李 紅 尹學(xué)智 徐改改 申瑞玲 畢艷蘭 呂喜麗

(鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院1，鄭州 450000) (河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院2，鄭州 450000)

磷脂是脂肪酸甘油酯通過(guò)磷酸根與膽堿、膽胺等不同基團(tuán)相連接而成的化合物[1]，其結(jié)構(gòu)具有由磷酸相連的取代基團(tuán)構(gòu)成的親水頭和由脂肪酸鏈構(gòu)成的疏水尾，是一種重要的兩親物質(zhì)，具有乳化、潤(rùn)濕、分散、增溶等特性[2]；此外，磷脂含有豐富的不飽和脂肪酸、膽堿、肌醇等營(yíng)養(yǎng)成分，是一種天然的營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[3]，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、飼料等工業(yè)[4]。然而，天然磷脂分子中的多不飽和脂肪酸對(duì)磷脂的穩(wěn)定性造成一定的威脅，易被氧化，使磷脂顏色加深，物理、化學(xué)性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也發(fā)生一定變化，很大程度上會(huì)限制磷脂的應(yīng)用[5]。因此，對(duì)磷脂進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，改變磷脂的脂肪酸組成，以提高磷脂的氧化穩(wěn)定性，改善磷脂的功能性質(zhì)，尤為重要。

酯交換是一種重要的磷脂結(jié)構(gòu)修飾方法，不但能改變磷脂的脂肪酸組成，還可以避免反式脂肪酸的生成。磷脂酯交換反應(yīng)主要有化學(xué)法和酶催化法兩種，化學(xué)法由于使用強(qiáng)堿(如甲醇鈉[6])作為催化劑，沒(méi)有專一性，Sn-1和Sn-2位的脂肪酸都會(huì)發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)溫度較高，常有副反應(yīng)發(fā)生；而酶法[7, 8]催化磷脂酯交換具有選擇性高，副反應(yīng)少，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)深受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。

目前，有關(guān)酶法酯交換在磷脂中引入飽和脂肪酸的研究多以棕櫚酸、癸酸、月桂酸等飽和酸或飽和脂肪酸的甲酯為?；w與卵磷脂進(jìn)行酸解反應(yīng)或酯交換反應(yīng)。班婷婷等[9]以 Lipozyme TLIM 為工具酶，在正己烷體系中催化醇溶性大豆磷脂與棕櫚酸的酸解反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在最佳反應(yīng)條件下得到的磷脂中的棕櫚酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.6%，且酯交換后的磷脂氧化穩(wěn)定性得到提高。Ghosh[10]采用微生物脂肪酶催化癸酸、月桂酸及豆蔻酸的甲酯與卵磷脂的酯交換反應(yīng)，結(jié)果表明，酯交換反應(yīng)中脂肪酸的結(jié)合程度與其分子質(zhì)量緊密相關(guān)，脂肪酸的分子質(zhì)量越大，與磷脂的結(jié)合程度越高；并發(fā)現(xiàn)酯交換反應(yīng)提高了卵磷脂的表面活性。

圖1 脂酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)

磷脂酶A1專一性催化天然磷脂的Sn-1 位?；乃夂王ソ粨Q反應(yīng)，生成 Sn-1溶血磷脂或Sn-1位脂肪酸酯交換改性磷脂。朱姍姍[11]在正己烷體系中，采用10%的固定化磷脂酶A1催化摩爾比為 1∶5的大豆磷脂與共軛亞油酸乙酯的酯交換反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)55 ℃下，72 h后，生成的改性磷脂中共軛亞油酸c9,t11-CLA 和t10,c12-CLA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 15.04%和 14.54%。馬彥慶等[8]報(bào)道了正己烷體系中，固定化磷脂酶 A1催化磷脂酰膽堿(PC) 富集物和二十二碳六烯酸(DHA) 濃縮液的酯交換反應(yīng)，得到了DHA含量為 17.7 mg/g PL的磷脂。

然而，脂肪酸或脂肪酸甲酯均是以甘三酯為原料制得的，如能以飽和脂肪酸甘三酯作為?；w，不僅能得到飽和脂肪酸含量高的磷脂，還能降低成本。目前，僅楊力會(huì)等[12, 13]報(bào)道了脂肪酶Lipozyme RM IM催化的棕櫚硬脂與大豆卵磷脂的酯交換的反應(yīng)，其他飽和脂肪酸甘三酯作為?；w的酯交換反應(yīng)鮮見報(bào)道。而全氫化大豆油棕櫚酸和硬脂酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)99%，可作為磷脂酯交換反應(yīng)良好的酰基供體。

此外，文獻(xiàn)報(bào)道的磷脂酯交換反應(yīng)基本都以價(jià)格昂貴的卵磷脂為底物，大豆粉末磷脂雖是卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂等組成的混合物，但對(duì)于研究磷脂與甘三酯的酯交換反應(yīng)，改變磷脂的脂肪酸組成，大豆粉末磷脂作為底物已足夠滿足需要，且價(jià)格相對(duì)卵磷脂便宜很多，增加了工業(yè)化生產(chǎn)的可能性。

本實(shí)驗(yàn)研究了脂酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)(如圖1)，考察了酶的種類、加酶量、底物摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、溫度等因素對(duì)酯交換反應(yīng)的影響，確定了合成改性磷脂的最佳工藝，為改性磷脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆粉末磷脂、全氫化大豆油、磷脂酶A1、脂肪酶NOVO435。

正己烷、硫代硫酸鈉、碘化鉀、一氯化碘、環(huán)己烷、冰乙酸、濃鹽酸、95%乙醇、甲醇、三氯甲烷、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硼酸、酚酞、淀粉、無(wú)水碳酸鈉、重鉻酸鉀，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ZRD-1熔點(diǎn)儀，DGX-9234B-2型電熱恒溫干燥箱， RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHB-Ⅲ循環(huán)水泵，TGL-16H高速離心機(jī)，TDL-80-2B 低速離心機(jī)，C10-W12P恒溫水浴磁力攪拌器，HGA-5L空氣發(fā)生器，GHL-300氫氣發(fā)生器，Agilent 6890N型氣相色譜儀，BGZ-240真空干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 酶催化酯交換反應(yīng)

準(zhǔn)確稱取一定量的大豆粉末磷脂和全氫化大豆油于50 mL錐形瓶中，加入一定的正己烷溶解(大豆粉末磷脂的濃度為0.2 g/mL)，加入一定量的酶，于一定溫度下在速率為100 r/min的磁力攪拌器中反應(yīng)，一定時(shí)間后，移入50 mL離心管，并用正己烷沖洗錐形瓶3次，保證磷脂被完全收集，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min，溫度為25 ℃下離心10 min，分出上清夜至100 mL圓底燒瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，待正己烷完全蒸出后，分3次加入30 mL丙酮，溶出未反應(yīng)的全氫化大豆油，并將固液混合物全部轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，在轉(zhuǎn)速8 000 r/min，溫度為25 ℃下離心10 min，傾去上清液，重復(fù)用20 mL丙酮洗滌、離心3次，刮出下層物質(zhì)置于已稱重培養(yǎng)皿中，在50 ℃真空干燥箱中干燥12 h，稱重，計(jì)算改性磷脂的產(chǎn)率，并測(cè)定所得樣品的碘值、熔點(diǎn)及脂肪酸組成。

1.3.2 碘值測(cè)定

碘值測(cè)定：參照GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定》。

1.3.3 熔點(diǎn)的測(cè)定

參照GB/T 12766—2008《動(dòng)物油脂 熔點(diǎn)測(cè)定》，采用熔點(diǎn)儀對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行熔點(diǎn)測(cè)定。

1.3.4 磷脂脂肪酸組成測(cè)定

參照GB 5009.168—2016 《食品中脂肪酸的測(cè)定》。

氣相色譜條件：色譜柱型號(hào)(BPX-70毛細(xì)管脂肪酸分析柱)，長(zhǎng)度(120.0 m) ，內(nèi)徑(250 μm)，膜厚(0.50 μm)，進(jìn)樣口溫度(210 ℃)，柱溫(180 ℃)，檢測(cè)器(FID)，空氣流速(400 mL/min)，氫氣流速(30 mL/min)，氮?dú)饬魉?0.6 mL/min)，檢測(cè)器溫度(300 ℃)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶催化大豆粉末磷脂酯交換反應(yīng)的單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 酶的選取

分別選用0.28 g磷脂酶A1和NOVOzyme435(20%以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))作為催化劑，催化50 ℃下，1.8 g全氫化大豆油與1.4 g大豆粉末磷脂(二者摩爾質(zhì)量比為3∶1)在正己烷體系中(磷脂濃度為0.20 g/mL)的酯交換反應(yīng)，18 h后測(cè)定酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率，結(jié)果如表1所示。與NOVOzyme435相比，磷脂酶A1催化得到改性磷脂的碘值較低，產(chǎn)率較高，因此，選用磷脂酶A1作為催化磷脂酯交換反應(yīng)的催化劑。

表1 不同酶催化下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

2.1.2 溫度對(duì)酯交換反應(yīng)的影響

分別在45、50、55、60、65 ℃下，摩爾質(zhì)量比為3∶1的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的正己烷溶液(磷脂濃度為0.20 g/mL)，在20%磷脂酶A1(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))催化下反應(yīng)18 h后測(cè)得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率作為考察指標(biāo)，對(duì)溫度作圖，見圖2。

圖2 不同反應(yīng)溫度下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

由圖2數(shù)據(jù)所知，溫度對(duì)酶的影響較大，當(dāng)溫度從45 ℃升至50 ℃時(shí)，產(chǎn)物的碘值逐漸降低、產(chǎn)率升高，表明磷脂酶A1催化酯交換反應(yīng)的速率在提升；當(dāng)反應(yīng)溫度高于50 ℃時(shí)，產(chǎn)物的碘值開始不斷升高、產(chǎn)率下降，表明酶催化效率開始降低。在50 ℃時(shí)產(chǎn)物的碘值最低，產(chǎn)率最高，原因可能是磷脂酶催化的酯交換反應(yīng)為界面反應(yīng)，在油水界面，酶與磷脂結(jié)合而發(fā)生水解，溫度升高使得體系的黏度降低、傳質(zhì)阻力減小、擴(kuò)散系數(shù)增大, 增加了底物分子與酶活性中心位點(diǎn)結(jié)合的幾率，有利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行；而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酶蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變而失活，以及可能會(huì)導(dǎo)致熱敏性磷脂變性[14]，所以該反應(yīng)溫度宜選50 ℃。

2.1.3 時(shí)間對(duì)酶法酯交換反應(yīng)的影響

在50 ℃下，摩爾質(zhì)量比為3∶1的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的正己烷溶液(磷脂濃度為0.20 g/mL)，在20%磷脂酶A1(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))催化下，分別反應(yīng)6、12、18、24、30 h后測(cè)得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率見圖3。

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間下酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率

由圖3數(shù)據(jù)可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，酯交換程度不斷增加，產(chǎn)物的碘值不斷降低，產(chǎn)率逐漸上升，但當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)18 h后，產(chǎn)物碘值出現(xiàn)上升趨勢(shì)，而產(chǎn)率也開始下降。反應(yīng)時(shí)間為18 h時(shí)，產(chǎn)物碘值最低，產(chǎn)率比反應(yīng)24 h稍低。究其原因可能是隨著反應(yīng)的進(jìn)行，水解產(chǎn)物溶血磷脂增加，與全氫化大豆油反應(yīng)速度加快[15]；然而，反應(yīng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，磷脂會(huì)有一定程度的氧化，同時(shí)，副反應(yīng)也在不斷的進(jìn)行，導(dǎo)致得率降低。因此，反應(yīng)時(shí)間選取18 h比較合適。

2.1.4 底物的摩爾質(zhì)量比對(duì)酶法酯交換反應(yīng)的影響

分別稱取不同摩爾質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂于正己烷中(磷脂濃度為0.20 g/mL)，在20%磷脂酶A1(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))催化下，于50 ℃下，反應(yīng)18 h后測(cè)得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率見圖4。

圖4 不同底物摩爾比下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

由圖4數(shù)據(jù)可知，隨著底物比不斷增大，產(chǎn)物的碘值逐漸減小、產(chǎn)率上升，但當(dāng)全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的摩爾比達(dá)到4∶1后，產(chǎn)物碘值出現(xiàn)升高、產(chǎn)率下降的趨勢(shì)。在底物摩爾質(zhì)量比(全氫化大豆油：大豆粉末磷脂)為3∶1時(shí)產(chǎn)物的碘值最低，產(chǎn)率比4∶1時(shí)稍低?？赡芤?yàn)殡S底物比不斷增大，磷脂與全氫化大豆油的接觸機(jī)會(huì)增大，反應(yīng)速率加快；然而，酶的添加量一定，隨全氫化大豆油量的增加，磷脂相對(duì)量有所降低，從而影響反應(yīng)效率，導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)率又降低。因此底物的摩爾質(zhì)量比(全氫化大豆油：大豆粉末磷脂)選3∶1。

2.1.5 酶的添加量對(duì)酶法酯交換反應(yīng)的影響

分別選用5%、10%、15%、20%、25%(以磷脂質(zhì)量為基準(zhǔn))的磷脂酶A1為催化劑，催化50 ℃下、摩爾質(zhì)量比為3∶1的全氫化大豆油與大豆粉末磷脂的正己烷溶液(磷脂濃度為0.20 g/mL)的酯交換反應(yīng)，18 h后測(cè)得的酯交換改性磷脂的碘值和產(chǎn)率見圖5。

圖5 不同酶添加量下酯交換改性磷脂的碘值及產(chǎn)率

由圖5數(shù)據(jù)可知，隨著酶添加量的增加，產(chǎn)物碘值逐漸降低、產(chǎn)率升高；當(dāng)酶添加量增至20%時(shí)，碘值最低；再繼續(xù)增大時(shí)碘值開始升高、產(chǎn)率也有所降低。原因可能是隨著酶添加量的不斷增大，更多的酶分子到達(dá)反應(yīng)界面參與反應(yīng)，進(jìn)而反應(yīng)產(chǎn)率提高；當(dāng)酶的添加量增大到一定值以后，酶與底物結(jié)合的活性位點(diǎn)達(dá)到飽和，會(huì)有一部分酶無(wú)法發(fā)揮作用，使得反應(yīng)趨于平衡[16]，然而，隨反應(yīng)時(shí)間不斷延長(zhǎng)，催化效果會(huì)有所下降。因此，酶的添加量在20%較為適宜。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

一個(gè)反應(yīng)的發(fā)生并不是單一因素決定，而是多個(gè)因素共同作用的結(jié)果，因此，非常有必要利用正交實(shí)驗(yàn)綜合考察反應(yīng)溫度、時(shí)間、底物摩爾比和酶的添加量等因素對(duì)酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)的影響。

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選取反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物摩爾比和酶添加量4個(gè)因素，每個(gè)因素分別選取3個(gè)水平(因素及水平表見表2)，建立L9(43)的正交實(shí)驗(yàn)。以產(chǎn)物的碘值和產(chǎn)率為指標(biāo)，確定大豆粉末磷脂與全氫化大豆油酯交換反應(yīng)的最佳條件。結(jié)果見表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平

表3 大豆粉末磷脂與全氫化大豆油酯交換反應(yīng)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，以碘值為衡量指標(biāo)，反應(yīng)溫度和底物比對(duì)大豆粉末磷脂與全氫化大豆油酯交換反應(yīng)影響都很大，其次是酶添加量，影響最小的是反應(yīng)時(shí)間，影響反應(yīng)因素主次依次為A=C>D>B，最優(yōu)反應(yīng)條件為A3B2C1D1，即反應(yīng)溫度為55 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、底物摩爾比為2∶1、加酶量為15%；以產(chǎn)率為衡量指標(biāo)，反應(yīng)溫度對(duì)酯交換反應(yīng)影響最大，其次是酶的添加量，再者為反應(yīng)時(shí)間，最后為底物比，影響反應(yīng)因素主次依次為A>D>B>C，最優(yōu)反應(yīng)條件為A2B2C3D3，即反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、底物摩爾比為4∶1、加酶量為25%。

2.3 最優(yōu)條件的驗(yàn)證

分別按照最優(yōu)反應(yīng)條件1(反應(yīng)溫度為55 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、底物摩爾比為2∶1、加酶量為15%)和最優(yōu)反應(yīng)條件2(反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、底物摩爾比為4∶1、加酶量為25%)進(jìn)行粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)，處理完畢后得到結(jié)果見表4。

表4 兩種最優(yōu)條件酯交換反應(yīng)結(jié)果

由表4數(shù)據(jù)可以看出，最優(yōu)反應(yīng)條件1得到的酯交換產(chǎn)物的碘值最低，是以碘值衡量得到的最佳反應(yīng)條件。最優(yōu)反應(yīng)條件2得到的酯交換產(chǎn)物的碘值52 gI/100 g雖比最優(yōu)條件1得到產(chǎn)物碘值51 gI/100 g稍高，但是產(chǎn)率卻比最優(yōu)條件1高出很多，因此選擇最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度為50 ℃、反應(yīng)時(shí)間24 h、底物摩爾比為4∶1、加酶量為25%。

2.4 酯交換反應(yīng)前后磷脂的熔點(diǎn)及碘值

酯交換反應(yīng)前后大豆粉末磷脂、全氫化大豆油和按最優(yōu)方法得到的改性磷脂的碘值及熔點(diǎn)見表5所示。由表5可知，改性磷脂的碘值由原料大豆粉末磷脂的89 gI/100 g降至改性磷脂的52 gI/100 g，說(shuō)明改性磷脂脂肪酸的雙鍵數(shù)目減少，大豆粉末磷脂中的不飽和脂肪酸與氫化大豆油中的飽和脂肪酸發(fā)生了酯交換反應(yīng)；此外，與原料磷脂的熔點(diǎn)相比，改性磷脂的熔點(diǎn)也發(fā)生了比較大的變化。

表5 原料大豆粉末磷脂、全氫化大豆油和改性磷脂的碘值及熔點(diǎn)

2.5 酯交換反應(yīng)前后磷脂的脂肪酸組成

全氫化大豆油及酯交換反應(yīng)前后磷脂經(jīng)氣相色譜分析，并按校正峰面積歸一化法計(jì)算得到相應(yīng)的脂肪酸組成如表6所示。

表6 氫化大豆油、大豆粉末磷脂及改性磷脂的脂肪酸組成(面積歸一法)/%

從表6可見，全氫化大豆油主要由硬脂酸、棕櫚酸和山崳酸組成。大豆粉末磷脂主要由亞油酸、棕櫚酸、油酸、亞麻酸、硬脂酸和山崳酸組成。

與原料大豆粉末磷脂相比，酯交換改性磷脂中飽和脂肪酸—硬脂酸的含量明顯增加，約為原料磷脂的9倍，棕櫚酸的含量稍有增加，山崳酸的含量卻有所降低；而不飽和脂肪酸含量大幅降低，亞油酸和亞麻酸的含量降低了一半，油酸含量也降低了30%左右。脂肪酸組成的變化同樣說(shuō)明了在磷脂酶A1作用下，全氫化大豆油與大豆粉末磷脂發(fā)生了酯交換反應(yīng)，得到了不飽和脂肪酸含量降低的改性磷脂。

3 結(jié)論

研究正己烷體系中，酶催化下大豆粉末磷脂與全氫化大豆油的酯交換反應(yīng)，考察了不同條件對(duì)酯交換反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在25%磷脂酶A1催化下，摩爾比為4∶1的全氫化大豆油和大豆粉末磷脂的正己烷溶液，在50 ℃下反應(yīng)24 h后，得到碘值為52 g/100 g、產(chǎn)率為72.9%、熔點(diǎn)為110.5～117.3 ℃的改性磷脂。

酯交換改性磷脂的飽和脂肪酸—硬脂酸的含量明顯增加，約為原料磷脂的9倍，而不飽和脂肪酸含量大幅降低，亞油酸及亞麻酸的含量降低了近一半，油酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低了30%左右，說(shuō)明在磷脂酶A1作用下，全氫化大豆油與大豆粉末磷脂發(fā)生了酯交換反應(yīng)，得到了不飽和脂肪酸含量降低的改性磷脂，實(shí)現(xiàn)了大豆粉末磷脂的結(jié)構(gòu)修飾。