陳培培，齊 心，張 燦

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)又稱(chēng)摩根菌，革蘭陰性短桿菌，屬于腸桿菌科摩氏摩根菌屬，廣泛存在于自然環(huán)境中，是一種條件致病菌，也是一種人獸共患病原菌[1]。摩根菌在動(dòng)物體抵抗力下降或者在腸道定植為優(yōu)勢(shì)菌群條件下，能夠引起人與動(dòng)物的各種感染，如泌尿道感染、傷口感染、肺部感染等，食用污染摩氏摩根菌的肉制品與海產(chǎn)品等可導(dǎo)致食物中毒[2-3]?？潞普涞萚4]報(bào)道摩根菌引起病人陰囊感染；王磊等[5]報(bào)道摩根菌引起野生的黑格爾七彩神仙魚(yú)皮膚潰爛甚至死亡。作者從豬小腸內(nèi)容物分離到1株疑似致病菌，通過(guò)培養(yǎng)特性、16S rDNA測(cè)序及同源性分析，確定其為摩氏摩根菌。通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)檢測(cè)其致病性，同時(shí)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)篩選其敏感藥物，旨在豐富該病原感染動(dòng)物的種類(lèi)，同時(shí)為防治摩根菌引起的感染提供用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、S.S.瓊脂、麥康凱瓊脂、LB肉湯和革蘭染色液，均購(gòu)自海博生物技術(shù)有限公司；19種藥敏紙片(新霉素、頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考、氨芐西林、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、鹽酸沙拉沙星、硫胺二甲嘧啶、單硫卡、多西環(huán)素、慶大霉素、諾氟沙星、紅霉素、鏈霉素、亞胺培南、美羅培南和氨曲南)，均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司；PCR相關(guān)試劑，購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 4周齡昆明系小鼠18只，購(gòu)自青島大任富城畜牧有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌分離與純化 無(wú)菌條件下取豬小腸內(nèi)容物，分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、S.S.瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，再挑取菌落形態(tài)特征明顯的單菌落，劃線傳代培養(yǎng)，純化4代以上，革蘭染色后鏡檢。

1.3.2 16S rDNA 擴(kuò)增和測(cè)序 以菌液為模板，根據(jù)廖中華等[6]報(bào)道的通用引物進(jìn)行16S rDNA的PCR。引物序列為：16S-F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′；16S-R：5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小為1 406 bp。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.3 同源性分析 將16S rDNA測(cè)序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，選擇同源性較高的13條序列，通過(guò)MEGA 7.0 軟件用Neighbor-Joining方法(默認(rèn)參數(shù))繪制進(jìn)化樹(shù)，并進(jìn)行同源性分析。

1.3.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將分離純化的細(xì)菌接種到LB液體培養(yǎng)基，37 ℃震蕩培養(yǎng)24 h至菌液濃度為1.0×1010CFU/mL。18只昆明系小鼠隨機(jī)分為3組：空白組、腹腔注射組和灌胃組，每組6只?？瞻捉M每只腹腔注射LB肉湯0.5 mL，腹腔注射組每只小鼠注射菌液0.5 mL，灌胃組每只小鼠灌胃菌液0.5 mL，觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，記錄結(jié)果。

1.3.5 藥敏試驗(yàn) 參照徐強(qiáng)等[7]所用的紙片擴(kuò)散法對(duì)19種藥物進(jìn)行敏感性檢測(cè)。用棉簽將菌液均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，待培養(yǎng)基完全吸收菌液后，將各藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面適當(dāng)?shù)奈恢茫?7 ℃ 培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑(mm)，參照EUCAST歐盟藥敏試驗(yàn)(2016年)[8]介紹的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌的分離及形態(tài)學(xué)特征 分離菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)狀況良好，37 ℃培養(yǎng)24 h后，形成圓潤(rùn)、光滑、邊緣整齊、不透明的乳白色菌落。在S.S.瓊脂平板上形成透明的小菌落，在麥康凱瓊脂平板上形成圓潤(rùn)、不透明的粉紅色菌落。染色鏡檢結(jié)果為粉紅色、單個(gè)或成對(duì)排列，兩端鈍圓的短桿菌，因此判定為革蘭陰性桿菌(見(jiàn)中插彩版圖1)。

2.2 藥敏試驗(yàn) 以19種常規(guī)抗生素對(duì)分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，分離菌株對(duì)頭孢噻肟、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、鹽酸沙拉沙星、鏈霉素、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南和氨曲南10種抗生素表現(xiàn)為敏感，氨芐西林、頭孢曲松、新霉素、單硫卡4種抗生素表現(xiàn)為中度敏感，恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、多西環(huán)素和諾氟沙星5種抗生素表現(xiàn)為耐受。

表1 分離菌株藥敏試驗(yàn)Table 1 Drug sensitivity test of isolated strain

2.3 16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增 以菌液為模板，進(jìn)行16S rDNA 的PCR 擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，擴(kuò)增得到與預(yù)期片段大小一致的目的片段，大小為1 406 bp。

圖2 分離菌株的16S rDNA 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 16S rDNA agarose gel electrophoresis results of isolated strainsM:DL-2 000 Marker;1～2:分離菌株;3.陰性對(duì)照M:DL-2 000 Marker;1～2:Isolated strain;3:Negative control

2.4 同源性分析 16S rDNA測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果表明，該菌株為摩根菌，菌株序列提交到GenBank，登錄號(hào)為MK361125。用Neighbor-Joining方法對(duì)該序列及其同源性較高的其他13條序列進(jìn)行同源性分析，繪制進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，分離菌株QX01與其余菌株有很高的同源性，均在97%以上。這些菌株分別來(lái)源于印度、中國(guó)、日本、比利時(shí)、加拿大和尼日利亞，說(shuō)明摩根菌在自然界中廣泛分布。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 分離菌株分別通過(guò)腹腔注射和灌胃途徑接種昆明系小鼠，檢測(cè)其致病性?；貧w試驗(yàn)結(jié)果顯示，空白組小鼠正常，未出現(xiàn)發(fā)病和死亡；腹腔注射組在注射10 h后全部死亡；灌胃組在1周內(nèi)全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn),腹腔注射組和灌胃組死亡小鼠肝臟和肺臟有不同程度地充血、出血現(xiàn)象(見(jiàn)中插彩版圖4)，病變的肝臟及肺臟在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、S.S.瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，分離到相同形態(tài)的菌落。

圖3 同源性分析Fig.3 Homology analysis▲：本試驗(yàn)所分離菌株▲：Strain isolated in this test

3 討論

摩根菌是一種人獸共患病原菌，致病性強(qiáng)且感染范圍廣泛，能夠引起人和動(dòng)物的肺炎、尿道炎、關(guān)節(jié)炎等病癥[9-10]。據(jù)報(bào)道多種水產(chǎn)動(dòng)物對(duì)摩根菌均易感。楊移斌等[11]從患病烏鱧肝、腎、脾及潰爛皮膚肌肉等組織器官分離到摩根菌；韋陽(yáng)道等[12]從患病胡子鯰脾臟中分離到強(qiáng)致病性的摩根菌。同時(shí)，摩根菌也是重要的醫(yī)院內(nèi)條件致病菌。譚家余等[13]報(bào)道了泌尿系統(tǒng)感染摩根菌，可導(dǎo)致感染性休克和多功能器官損傷；朱永琪等[9]報(bào)道摩根菌引起1名順產(chǎn)后產(chǎn)婦重癥感染的病例。家畜感染摩根菌發(fā)病病例報(bào)告較少。本實(shí)驗(yàn)室從豬的小腸內(nèi)容物中分離到菌株，經(jīng)16S rDNA測(cè)序及同源性分析鑒定為摩根菌。據(jù)筆者所知，這是國(guó)內(nèi)首次分離到的豬源摩根菌。該菌以不同的途徑感染昆明系小鼠，通過(guò)腹腔注射和消化道途徑均能導(dǎo)致小鼠內(nèi)臟器官不同程度的出血腫脹等病變，說(shuō)明分離株QX01具有較強(qiáng)致病性。廖中華等[6]從山羊中分離到的摩根菌腹腔注射途徑能引起感染，但是消化道途徑不能引起感染，說(shuō)明不同的摩根菌菌株致病性存在差異。目前該菌的感染機(jī)制和致病機(jī)理尚不明確，需要進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)對(duì)該菌進(jìn)行了19種藥物的敏感性檢測(cè)。已有報(bào)道表明，摩根菌對(duì)多種常用抗生素具有耐受性。李雪峰等[14]報(bào)道該菌對(duì)氨芐西林、氟苯尼考和復(fù)方新諾明等耐受；蘭云等[15]報(bào)道利福平、呋喃妥因和頭孢噻吩等耐受。本試驗(yàn)中分離到的摩根菌QX01對(duì)頭孢噻肟等14種藥物敏感或中度敏感，對(duì)恩諾沙星、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、多西環(huán)素和諾氟沙星5種藥物耐受，這與之前報(bào)道存在差異，說(shuō)明不同地區(qū)分離到的摩根菌菌株對(duì)藥物的敏感性各不相同，受當(dāng)?shù)乜股厥褂们闆r影響，提示養(yǎng)殖戶(hù)在養(yǎng)殖過(guò)程中要慎重、合理用藥。

本次試驗(yàn)首次從豬的小腸內(nèi)容物中分離到具有致病性的摩根菌，當(dāng)豬只抵抗力下降時(shí)，可能引起豬只感染，造成經(jīng)濟(jì)損失，其潛在危害應(yīng)引起養(yǎng)殖戶(hù)的重視。