徐倩倩，呂素芳，李 峰，張冉冉，王怡晴，劉青青，王艷萍，沈志強(qiáng)

(1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 山東省濱州畜禽蜂膠疫苗研究開發(fā)推廣中心，山東 濱州 256600；2.山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東 濱州 256600；3.濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264003)

大腸桿菌感染引起的豬病主要有新生仔豬腹瀉、斷奶仔豬腹瀉(PWD)、水腫病(ED)[1]等。隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，致病性大腸桿菌所導(dǎo)致的仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病，成為養(yǎng)豬場(chǎng)常發(fā)的傳染病，也是引起仔豬死亡的重要原因之一，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成較大的威脅和重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。全國(guó)多地都有豬源大腸桿菌多重耐藥的報(bào)道[3-4]。尋找替代抗生素的治療或者預(yù)防方法成為畜牧業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展亟需解決的問題。在我國(guó)，利用中藥防治腹瀉己有幾千年的歷史，并在防治畜禽疾病中發(fā)揮了巨大作用。近年研究顯示，中藥如黃芩、黃連、黃柏等對(duì)豬源大腸桿菌皆有不同程度的體外抑菌效果[5-7]，中藥對(duì)于大腸桿菌能有效抑菌,臨床治愈率為90%之多[8]。因此，本試驗(yàn)的目的是篩選對(duì)臨床分離多重耐藥豬大腸桿菌有抑菌、殺菌作用的中藥，并分析部分中藥的聯(lián)合抑菌效果，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥材 烏梅、茵陳、魚腥草、連翹、射干、青蒿、知母、薄荷、香薷、蒼術(shù)、陳皮、石菖蒲、艾葉、黃芪、大黃、黃芩、蒲公英、當(dāng)歸、訶子、五味子、金銀花、炙甘草、黃連、板藍(lán)根、山楂、蘆薈、大青葉、紫花地丁、苦參、梔子、厚樸、白頭翁、秦皮、黃柏、胡黃連、穿心蓮、蘇木、白芷，均購自山東濱州瑞豐藥店，所有藥材飲片經(jīng)鑒定均符合生藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

藥敏紙片7種，阿米卡星[批號(hào)：180926，含量：(30±7.5) μg/片]、慶大霉素[批號(hào)：180927，含量：(10±2.5) μg/片]、左氟沙星(批號(hào)：180922，含量：5 μg/片)、青霉素G(批號(hào)：180913，含量：10 U/片)、多黏菌素B(批號(hào)：180923，含量：300 U/片)、鏈霉素(批號(hào)：180908，含量：10 μg/片)、阿莫西林(批號(hào)：180829，含量：10 μg/片)，均購自杭州市濱和微生物試劑有限公司。

1.2 供試菌株 豬大腸桿菌均為臨床分離株，由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院李峰研究員惠贈(zèng)；豬大腸桿菌O101：K41(菌株編號(hào)為ATCC83707)為標(biāo)準(zhǔn)菌株，由山東綠都生物科技有限公司菌種中心提供。

1.3 培養(yǎng)基、試劑 普通肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：20160810)，購自青島市高科園海博生物技術(shù)有限公司。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：160618 14)、M-H肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：160321 1)、M-H瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：180822 1)，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。按照說明書操作，高壓滅菌后使用。麥?zhǔn)媳葷峁?批號(hào)：RJ19030)購自溫州市康泰生物科技有限公司。

1.4 主要儀器設(shè)備 KDM型調(diào)溫電熱套，購自山東甄城華魯電熱儀器有限公司；RZ-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，購自上海嘉鵬科技有限公司；SHB-B95A型循環(huán)水式多用真空泵，購自上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；TDL-5-A低速大容量離心機(jī)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；新華牌LMQ.C型立式滅菌器，購自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；300型電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自龍口市先科儀器公司；96微孔板，購自上海拜力生物科技有限公司；SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)，購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；8通道微量移液器(10～100 μL)、單道移液器(10～100 μL、100～1 000 μL)，購自Thermo公司；ZD-85恒溫振蕩器，購自常州國(guó)華電器有限公司；BCD-199FD冰箱，購自澳柯瑪股份公司；210.3型電子天平，購自上海賽多利斯儀器設(shè)備有限公司。

1.5 中藥提取液的制備 分別取各單味藥材大青葉、紫花地丁、梔子、金銀花、魚腥草、青蒿、薄荷、艾葉、蒲公英、穿心蓮各30 g，加10倍量水浸潤(rùn)30 min，然后添加到12倍量的水加熱煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h，過濾，濾渣再加10倍量水煎煮1 h，過濾，取上清，合并2次藥液；另外，烏梅、茵陳、連翹、射干、知母、香薷、蒼術(shù)、陳皮、石菖蒲、黃芪、大黃、黃芩、當(dāng)歸、訶子、五味子、炙甘草、黃連、板藍(lán)根、山楂、蘆薈、苦參、厚樸、白頭翁、秦皮、黃柏、胡黃連、蘇木、白芷，分別各取50 g，加8倍量水浸潤(rùn)30 min，然后添加到10倍量的水加熱煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h，過濾，濾渣再加10倍量水煎煮1 h，過濾，取上清，合并2次藥液，減壓濃縮到0.5 g/mL，3 000 r/min離心15 min，取上清，繼續(xù)濃縮至1 g/mL，105 ℃滅菌20 min，4 ℃保存，備用。

1.6 中藥制備液對(duì)豬大腸桿菌的體外抑菌效果

1.6.1 菌液的培養(yǎng) 試驗(yàn)前將菌種接種到普通肉湯培養(yǎng)基中，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使其活化，然后挑取典型菌落接種于5 mL普通營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，連續(xù)培養(yǎng)2代。第3代置37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4 h左右，使其濁度達(dá)到1×106CFU/mL，備用。

1.6.2 紙片法測(cè)定常見抗生素對(duì)豬大腸桿菌的體外抑菌活性 取100 μL細(xì)菌培養(yǎng)液，分別接種涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基平板，取阿米卡星、慶大霉素、左氟沙星、青霉素G、黏菌素B、鏈霉素、阿莫西林等7種藥物的藥敏紙片均勻貼在平板表面，每個(gè)平板3種或4種紙片，每種藥物重復(fù)3次，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑(mm)。根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)K-B紙片法判斷結(jié)果。

1.6.3 中藥制備液對(duì)大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)測(cè)定 取滅菌M-H肉湯培養(yǎng)基100 μL分別加入第2孔到第9孔，及第12孔；第1孔、第2孔和第10孔分別加入100 μL待測(cè)藥液，從第2孔開始依次倍比稀釋到第9孔；第1孔到第9孔及第11孔分別加入100 μL菌液，即：第1孔到第9孔的中藥制備液濃度分別為(500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9、1.95 mg/mL)，第10孔為藥物對(duì)照，第11孔為菌液對(duì)照，第12孔為肉湯培養(yǎng)基對(duì)照，每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)重復(fù)，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后取出。從各試驗(yàn)孔中分別取100 μL液體接種涂布于M-H瓊脂培養(yǎng)基平板，經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果。以菌落分散生長(zhǎng)的視為有抑菌效果，此最低濃度值為其MIC值；以肉眼觀察無菌落生長(zhǎng)為100%被殺滅，此最低濃度值為其MBC值。參考代如意等[9]介紹的判斷標(biāo)準(zhǔn)，MIC<7.8 mg/mL為高度敏感，7.8 mg/mL≤MIC≤250.00 mg/mL為中度敏感，MIC>250.00 mg/mL為不敏感。

1.6.4 10味中藥聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 采用肉湯稀釋棋盤法，測(cè)定10味中藥聯(lián)合作用時(shí)的體外抗菌活性，以各中藥對(duì)應(yīng)MIC值的2倍、1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍等濃度分別進(jìn)行聯(lián)合藥敏試驗(yàn)，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果以聯(lián)合抑菌指數(shù)(Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)：FICI≤0.5為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用。FICI計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果

2.1 耐藥性分析 以豬大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC83707作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)臨床分離大腸桿菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、左氟沙星、青霉素G、鏈霉素、阿莫西林均耐藥，僅對(duì)多黏菌素B敏感；而標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)青霉素G和阿莫西林耐藥，對(duì)其他5種常見抗生素均敏感。

表1 臨床分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Sensitivity of clinical isolated Escherichia coli and standard strain ATCC83707 to antibiotics

2.2 中藥制備水提液對(duì)大腸桿菌的體外作用 根據(jù)7.8 mg/mL≤MIC≤250.00 mg/mL為中度敏感的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)臨床分離大腸桿菌對(duì)黃連、山楂、蘆薈、白頭翁、烏梅、香薷、艾葉、黃芩、蒲公英、訶子、五味子、蘇木表現(xiàn)為中度敏感，對(duì)其他中藥表現(xiàn)為不敏感；ATCC83707對(duì)黃連、山楂、蘆薈、大青葉、白頭翁、烏梅、艾葉、訶子、五味子、蘇木中度敏感，對(duì)其他藥物不敏感。

表2 38味中藥對(duì)臨床分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC、MBC測(cè)定結(jié)果Table 2 MIC and MBC of 38 TCMs against clinical isolated Escherichia coli and standard strain ATCC83707 (mg/mL)

2.3 10味中藥提取液對(duì)臨床分離菌株的聯(lián)合抑菌效果 10味中藥提取物對(duì)臨床分離菌株的體外聯(lián)合抑菌活性見表3。黃連-蘆薈、黃連-訶子、山楂-蘆薈、山楂-訶子、山楂-訶子、蘆薈-烏梅、訶子-白頭翁等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用；黃連-山楂、黃連-烏梅、黃連-白頭翁、山楂-香薷、蘆薈-五味子、烏梅-香薷、烏梅-訶子、黃芩-訶子、訶子-五味子等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)相加作用；黃連-香薷、黃連-五味子等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)無關(guān)作用；剩余藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)拮抗作用。

3 討論

3.1 中獸藥仍然是治療細(xì)菌性疾病的方向 細(xì)菌的多重耐藥問題已成為世界關(guān)注的問題，我國(guó)也不斷減少獸醫(yī)臨床抗生素的用量和品種，逐漸尋找抗生素的替代產(chǎn)品。中獸藥具有的天然獨(dú)特優(yōu)勢(shì)促使其理所當(dāng)然地成為良好備選之一。對(duì)比臨床分離多重耐藥大腸桿菌和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照菌株，抗生素作用顯示出極大差別，臨床分離菌株僅對(duì)多黏菌素B敏感，對(duì)其他受試抗生素均表現(xiàn)耐藥，而標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)大部分抗生素表現(xiàn)敏感，說明抗生素的可用范圍正在減?。欢鴮?duì)比中獸藥，臨床分離菌株對(duì)黃連等12味中獸藥中度敏感，標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)10味中獸藥中度敏感；2種菌株均對(duì)黃連、山楂、蘆薈、白頭翁、烏梅、艾葉、訶子、五味子、蘇木表現(xiàn)為中度敏感，這與一些報(bào)道的結(jié)果也是一致的[10]。香薷、黃芩、蒲公英臨床分離菌株敏感，而對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株不敏感，說明中獸藥抗菌作用目前還未受到細(xì)菌耐藥與否的影響，因此中獸藥仍然是治療細(xì)菌性疾病的方向。

3.2 中獸藥的開發(fā)利用還有很長(zhǎng)的路要走 在試驗(yàn)過程中，最初選擇了牛津杯法、紙片法，但一些問題限制了上述2種方法的應(yīng)用：成分復(fù)雜，有的成分影響藥物在瓊脂中的擴(kuò)散，例如牛津杯法測(cè)定黃柏的抑菌效果時(shí)，黃柏本身的黏稠性使其難以擴(kuò)散，影響結(jié)果觀察；中獸藥提取液中含有使紙片硬化的成分，一些中獸藥做成紙片后，藥物擴(kuò)散不出。最終我們選擇的微量2倍稀釋法結(jié)合平板法，避免了顏色和雜質(zhì)對(duì)結(jié)果判定的影響。

相比西藥，我們發(fā)現(xiàn)中獸藥有一定的抑菌效果，但其有效藥物濃度遠(yuǎn)高于西藥，在臨床應(yīng)用時(shí)受到很大限制，也有一些中獸藥通過進(jìn)一步分離提取純化達(dá)到了較好的效果，例如黃芩苷對(duì)大腸桿菌的MIC為16 μg/mL[11]。還有另外一種可能就是中獸藥作用的方式存在多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在抑菌的同時(shí)還有抗炎、抗氧化、改變離子流動(dòng)等其他作用途徑[12-13]，具體的作用機(jī)制及用藥方式還需要進(jìn)一步研究。

表3 中藥對(duì)臨床分離大腸桿菌的聯(lián)合抑菌活性Table 3 FICI of sensitive TCM combination to clinical isolated Escherichia coli

3.3 聯(lián)合用藥后效果差別大 七情配伍是中藥用藥基礎(chǔ)，本試驗(yàn)中，黃連-蘆薈等7對(duì)聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，可理解為相使配伍；黃連-山楂等9對(duì)中藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)相加作用，可理解為相須配伍；黃連-香薷、黃連-五味子等聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株呈現(xiàn)無關(guān)作用，可單獨(dú)用藥；其余27對(duì)藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)臨床分離大腸桿菌菌株均呈現(xiàn)拮抗作用，可理解為相惡配伍。在文獻(xiàn)報(bào)道中，復(fù)方中藥不同配伍對(duì)臨床分離株大腸桿菌也呈現(xiàn)了不同的敏感性[14]。因此，在中獸藥臨床用藥中，在研究單味藥作用的同時(shí)，聯(lián)合用藥的藥效研究也是必不可少的。

3.4 一株菌不具有普遍意義 大腸桿菌多重耐藥的現(xiàn)狀是逐漸演變而來的，基因組也發(fā)生了不同的改變，因此，1株菌對(duì)中獸藥的敏感性只能給出一點(diǎn)提示，而不能代表全部，本試驗(yàn)中臨床分離大腸桿菌對(duì)黃連MIC為250 mg/mL，對(duì)黃芩MIC為62.5 mg/mL，而文獻(xiàn)報(bào)道中黃連對(duì)豬大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑19 mm，遠(yuǎn)高于黃芩11.6 mm[15]。因此，在研究過程中，還需要擴(kuò)大臨床細(xì)菌樣本量，篩選效果穩(wěn)定的，對(duì)各種菌株均具有抑菌效果的中藥。

4 結(jié)論

臨床分離大腸桿菌對(duì)常用抗生素呈現(xiàn)了多重耐藥趨勢(shì)，但對(duì)中藥仍然保持一定的敏感性，中獸藥可作為優(yōu)良的抗菌產(chǎn)品；抗菌方面，中藥之間存在著復(fù)雜的相互作用，部分中藥間有協(xié)同作用或者拮抗作用，故臨床用藥時(shí)須謹(jǐn)慎篩選。