李丹丹,王乃福，王綏家,劉忠梅，王 昱，周曉黎，艾 軍，高慎陽,凌宗帥，李應(yīng)國

(1.中華人民共和國?？诤ｊP(guān)，海南 ?？?570311；2.中華人民共和國天津海關(guān)，天津 和平 300457；3.中華人民共和國哈爾濱海關(guān)，黑龍江 哈爾濱 150000；4.中華人民共和國重慶海關(guān)，重慶 渝北 400020；5.中華人民共和國昆明海關(guān)，云南 昆明 650228；6.錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧 錦州 121001；7.中華人民共和國濟(jì)南海關(guān)，山東 濟(jì)南 250014)

嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型(Simian T-lymphotropic virus 1,STLV1)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科正逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科δ逆轉(zhuǎn)錄病毒屬[1]，主要侵害猴的免疫系統(tǒng)，引起免疫器官的病變及免疫機(jī)能紊亂，從而干擾試驗(yàn)研究[2]，是普通級(jí)和SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)猴的必須篩查的重要病原之一。STLV1-30蛋白結(jié)構(gòu)具有保守性和種屬特異性[1]，本研究利用基因工程技術(shù)制備的重組STLV1-30蛋白作為診斷抗原，建立了免疫梳方法(ICA)用于對(duì)實(shí)驗(yàn)猴血清中STLV1 IgG抗體進(jìn)行特異性檢測(cè)，為STLV1抗體快速檢測(cè)提供有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、試劑及臨床樣品 感受態(tài)細(xì)胞(Copetent cell)、pMD18-T載體、E.coliDH5α和pGEX-4T-1，均購自寶生物工程(大連)有限公司；BL21(DE3)pLysS感受態(tài)表達(dá)菌，購自天根生化科技(北京)有限公司；2×TaqMaster Mix、DL-2 000 DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒和快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；堿性磷酸酶顯色底物液(BICP/NBT)、IPTG和NC膜為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；EcoR Ⅰ、T4 DNA連接酶、SmaI為NEB產(chǎn)品；兔抗猴IgG二抗為上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司產(chǎn)品；商品化的STLV抗體ELISA試劑盒為蘇州西山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；猴D型反轉(zhuǎn)錄病毒(Simian type-dretro virus,SRV)、猴B病毒(Monkey B virus,BV)、猴免疫缺陷病毒(Simian immunodeficiency virus,SIV)、麻疹病毒(Measles virus,MeV)和猴T淋巴細(xì)胞白血病病毒(Simian T-lymphotropic virus,STLV)這5種病毒的陽性血清及臨床血清樣品均來源于海南某實(shí)驗(yàn)猴場(chǎng)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank登錄的STLV1的核酸序列(GenBank:KY655313.1)進(jìn)行初步理論篩選并標(biāo)識(shí)目標(biāo)序列，見表1。

表1 STLV1目標(biāo)抗原表位序列的確定Table 1 Determination of antigenic epitopes sequence

在確定目標(biāo)抗原表位序列位置大小之后，為提高目標(biāo)抗原表位的合成效率利用OLIGO 7軟件設(shè)計(jì)重復(fù)串聯(lián)抗原表位基因序列，如下：5′-GAATTCCACCTCACTTATGATGCAGTCCCCACGGTACCTAT-ACGGTCCCGCTGGCACCTCACTTATGATGCAGTCC-CCACGGTACCTATACGGTCCCGCTGGCTCGAG-3′。利用交疊延伸PCR(SOE-PCR)的原理設(shè)計(jì)擴(kuò)增猴STLV1病毒STLV1表位序列的SOE-PCR擴(kuò)增引物[4-5]，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列如下：

SRV1F：5′-GAATTCAATAATCAAAACCTCATTATA-GCAGGCTGTCCCGAAAATAAAAAGGGCAATAA-3′

SRV1R：5′-CTCGAGGCCCTTTTTATTTTCGGGACA-GCCTGCTATAATGAGGTTTTGATTATTGCCCT-3′

1.3 STLV1-30蛋白的表達(dá)與鑒定

1.3.1 目的基因的擴(kuò)增與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 反應(yīng)體系：引物各2 μL，2×TaqMaster Mix 15 μL，超純水13 μL，總體系30 μL。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。用DNA回收試劑盒回收交疊式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，用SmaⅠ與EcoRⅠ同時(shí)分別雙酶切含有猴STLV1表位基因的克隆質(zhì)粒pMD18T- STLV1和表達(dá)載體pGEX-4T-1，用T4 DNA 連接酶進(jìn)行連接，16 ℃過夜，轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽性菌落并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，陽性菌體命名為pGEX-4T-STLV1。

1.3.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定 將陽性重組菌pGEX-4T-STLV1/BL21(DE3)10 μL接種到5 mL含有25 μg的氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)后，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)5 h；取誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體超聲破碎，SDS-PAGE電泳分析。

1.3.3 目的蛋白的純化和Western Blot鑒定 采用KCl染色切膠純化方法進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物的純化[6-7]。

1.3.4 Western Blot確定最佳抗原包被量 將陽性血清按1∶50固定濃度稀釋，將純化定量后的目的蛋白進(jìn)行10倍遞增稀釋后包被NC膜，然后進(jìn)行Western Blot分析[6-7]，篩選抗原最佳包被量。

1.3.5 表達(dá)蛋白的Western Blot特異性檢測(cè) 以1.3.4中抗原最佳包被量為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行方法的特異性驗(yàn)證。選擇將猴STLV1陽性血清作為待檢一抗進(jìn)行Western Blot特異性檢測(cè)。

1.3.6 表達(dá)蛋白的Western Blot敏感性檢測(cè) 將猴STLV1陽性參照血清進(jìn)行2倍倍比稀釋(1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800)后分別進(jìn)行敏感性檢驗(yàn)，確定最大檢測(cè)稀釋度。

1.3.7 免疫梳檢測(cè)試紙的制備、使用方法與判定方法 免疫梳檢測(cè)試紙的制備、使用方法與判定方法參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。

1.3.8 免疫梳檢測(cè)的特異性鑒定 利用制備好的免疫梳檢測(cè)試紙分別對(duì)STLV1、SRV1、BV、SIV和MeV陽性血清1∶50倍稀釋后進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.3.9 免疫梳檢測(cè)的敏感性試驗(yàn) 將陽性對(duì)照和陰性對(duì)照血清分別進(jìn)行50倍稀釋，再將猴STLV1陽性血清分別進(jìn)行1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400倍比稀釋，根據(jù)優(yōu)化后的免疫梳操作程序進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的靈敏度。

1.3.10 免疫梳的重復(fù)性與穩(wěn)定性檢測(cè) 將制備好的猴STLV1抗體免疫梳，進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性，每份樣品重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)情況；再將同一批次的檢測(cè)試紙分別4 ℃保存1個(gè)月、3個(gè)月和6個(gè)月后進(jìn)行穩(wěn)定性驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)分析免疫梳的特異性與敏感性變化情況，比較分析其穩(wěn)定性。

1.3.11 免疫梳實(shí)際應(yīng)用評(píng)價(jià) 利用制備好的免疫梳與商品化的ELISA檢測(cè)試劑盒分別進(jìn)行檢測(cè)比較，以此驗(yàn)證其可靠性。

2 結(jié)果

2.1 猴嗜T淋巴細(xì)胞趨向性病毒I型抗原表位基因的PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank登錄的猴STLV1的核酸序列(GenBank:KY655313.1)，生物合成基因片段作為模板，STLV1-30基因特異性引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增后，得到了約108 bp 的目的片段,與預(yù)計(jì)片段大小相符(見圖1)。

2.2STLV1-30基因測(cè)序 DNA 序列測(cè)定結(jié)果表明，所獲得序列長度為108 bp，與GenBank 上登錄的相應(yīng)序列完全一致。

2.3 重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-STLV1的鑒定 將表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-STLV1經(jīng)SmaⅠ/EcoR Ⅰ雙酶切和電泳后，獲得的條帶大小符合預(yù)期，結(jié)合最終的測(cè)序結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證，表明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確，結(jié)果見圖2所示。

圖1 擴(kuò)增片段產(chǎn)物Fig.1 Amplified fragment productsM:DL-2 000 Marker;1:陰性對(duì)照;2:擴(kuò)增片段M:DNA Marker 2 000;1:Negative control;2:Amplified fragment

圖2 STLV1抗原表位基因重組表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果 Fig.2 Enzyme digestion result of STLV1 epitope gene recombinant expression vectorM:DNA Marker DS 5 000 Ladder;1:Sma I/EcoR Ⅰ 雙切質(zhì)粒pGEX-4T-STLV1;2:質(zhì)粒pGEX-4T-STLV1M:DNA Marker DS 5 000 Ladder;1:Sma I/EcoR Ⅰ double cut plasmid pGEX-4T-STLV1;2:Plasmid pGEX-4T-STLV1

2.4 STLV1表位抗原蛋白的SDS-PAGE分析 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的重組菌BL21(DE3)pLysS通過SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖3所示，目的病毒表位抗原獲得表達(dá)，大小為29 ku，符合預(yù)期(見圖3)。

2.5 STLV1表位抗原蛋白的純化 將STLV1重組表位抗原表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖4，STLV1-30蛋白成功回收且純度均一。

2.6 Western Blot確定STLV1抗原最佳包被量 對(duì)抗原包被量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖5所示，從肉眼可見度判定，以102稀釋倍數(shù)的量濃度(0.02 mg/mL)確定為最佳包被量。

圖3 STLV1-30蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果Fig.3 Results of STLV1-30 protein SDS-PAGE analysis1:空載體菌誘導(dǎo)對(duì)照;2:重組菌表達(dá)蛋白;M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)1:Vector control induced by bacteria;2:Expression protein of recombinant bacteria;M:Protein marker

圖4 STLV1-30蛋白的純化結(jié)果Fig.4 Results of STLV1-30 protein purificationM:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:切膠純化后的重組表達(dá)蛋白STLV1-30M:Protein marker;1:Purified protein STLV1-30

圖5 重組STLV1-30蛋白抗原最佳包被量確定Fig.5 Determine the amount of STLV1-30 recombinant protein antigen1～6:STLV1-30蛋白包被濃度依次分別為2 mg/mL、0.2 mg/mL、0.02 mg/mL、2 μg/mL、200 ng/mL、20 ng/mL和2 ng/mL1～6:STLV1-30 protein coating concentration,2 mg/mL,0.2 mg/mL,0.02 mg/mL,2 μg/mL,200 ng/mL,20 ng/mL and 2 ng/mL,respectively

2.7 重組STLV1-30蛋白抗原特異性分析 特異性分析結(jié)果如圖6所示，STLV1-30蛋白能夠特異性地識(shí)別STLV1陽性血清而不與其他參考的猴病毒陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，說明了STLV1-30抗原具有良好的特異性。

2.8 重組STLV1-30蛋白抗原敏感性分析 敏感性分析結(jié)果如圖7所示，STLV1-30能夠敏感地檢測(cè)到1∶200倍稀釋的STLV1陽性血清，說明重組STLV1-30抗原敏感性良好。

2.9 STLV1抗體檢測(cè)免疫梳的特異性檢驗(yàn) 特異性驗(yàn)證結(jié)果如圖8所示，STLV1抗體免疫梳均能夠特異性檢測(cè)到相應(yīng)的STLV1陽性血清而不與其他病毒陽性血清間發(fā)生交叉反應(yīng)，由此說明設(shè)計(jì)制備的STLV1免疫梳特異性良好。

2.10 STLV1抗體檢測(cè)免疫梳的敏感性檢驗(yàn) 敏感性驗(yàn)證結(jié)果如圖9所示，STLV1抗體免疫梳的最大血清陽性檢測(cè)稀釋度為1∶400，說明了STLV1免疫梳敏感性良好達(dá)到了預(yù)期。

圖8 STLV1抗體免疫梳的特異性檢測(cè)結(jié)果Fig.8 Specificity of STLV1 antibody immune-comb assay+/-:1∶50 STLV1陽性/陰性血清抗體對(duì)照;1:抗猴1∶50 STLV1病毒陽性血清;2～6:抗猴1∶25的BV、SRV1、SIV、MeV病毒陽性血清對(duì)照和1∶25的STLV1病毒陰性血清對(duì)照;7～10:抗猴1∶50的BV、SRV1、SIV和MeV病毒陽性血清對(duì)照+/-:STLV1 positive/negative serum antibody control of 1∶50;1:STLV1 positive serum of 1∶50;2～6:BV/SRV1/SIV/MeV positive serum control of 1∶25 and STLV1 negative serum control of 1∶25;7～10:BV,SRV1,SIV and MeV positive serum control of 1∶50

圖9 制備的STLV1抗體檢測(cè)免疫梳的敏感性檢驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Sensitivity of STLV1 antibody immune-comb assay+/-:1∶50STLV1陽性/陰性血清抗體對(duì)照;1～9:1∶25/50/100/200/400/800/1 600/3 200/6 400倍稀釋的抗STLV1陽性血清;10:空白對(duì)照+/-:STLV1 positive/negative serum antibody control of 1∶50;1～9:Diluted positive serum of STLV1 virus of 1∶25/50/100/200/400/800/1 600/3 200/6 400;10:Blank control

2.11 免疫梳重復(fù)性和穩(wěn)定性 重復(fù)性和穩(wěn)定性結(jié)果如表2所示，批間重復(fù)試驗(yàn)CV為 5.183 051%，小于6%，批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)(CV)為6.666 667%，小于7%，說明免疫的重復(fù)性良好；穩(wěn)定性結(jié)果，免疫梳的特異性與敏感性沒有明顯變化，對(duì)同一份樣品平行作3次進(jìn)行比較，CV為5.033 223%，小于6%，說明免疫梳的穩(wěn)定性良好。

2.12 臨床測(cè)試比較和應(yīng)用結(jié)果 用制備的免疫梳與商品化的ELISA試劑盒對(duì)11只實(shí)驗(yàn)猴的STLV血清抗體進(jìn)行對(duì)比檢驗(yàn)分析，結(jié)果如表3所示，新建立的免疫梳(IC-猴STLV1-Ab)方法與參考的ELISA檢測(cè)結(jié)果一致率為100.0%，Kappa=1.000，這說明建立的免疫梳(IC-猴STLV1-Ab)方法與商品化試劑盒結(jié)果完全一致，顯示出良好的實(shí)用性和可靠性。

3 討論

1992年，我國衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)》就已明確規(guī)定STLV是SPF實(shí)驗(yàn)猴必須排除的病毒。STLV1與人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型(Human T-lymphotropic virus 1,HTLV1)有很多相似性，核酸序列上同源性高達(dá)90%～95%。STLV1最初從亞洲和非洲猴體內(nèi)分離到[2]，受STLV1感染的非洲綠猴出現(xiàn)了與受HTLV感染的人相似的貧血癥；人工繁殖猴和野生猴均可被STLV1感染，但無臨床癥狀表現(xiàn)。STLV1的存在不僅影響獼猴的實(shí)驗(yàn)等級(jí)，而且對(duì)飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員的健康也存在很大的隱患。李紹東等[3]對(duì)我國恒河猴的STLV1流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國野生和人工飼養(yǎng)的恒河猴的血清中普遍存在著STLV1抗體，因此對(duì)STLV1抗體的常規(guī)監(jiān)測(cè)意義重大。免疫梳方法(Immune-comb assay,ICA)是一項(xiàng)新型抗體體外定性、定量檢測(cè)技術(shù)，該方法簡(jiǎn)便、快捷、成本低、不需要貴重儀器等，適用于樣品的快速初篩和野外現(xiàn)場(chǎng)實(shí)地檢測(cè)，達(dá)到快速診斷的目的，能夠滿足口岸檢疫快速通關(guān)的要求，在基層具養(yǎng)猴場(chǎng)也具有良好的運(yùn)用推廣前景。

表2 ICA重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 2 The repeatability and stability evaluation of the ICA

表3 臨床測(cè)試結(jié)果Table 3 The results of clinical test

由于非人靈長類動(dòng)物與人類的生物及行為特征相似，成為了醫(yī)學(xué)研究中理想的動(dòng)物模型，我國是靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物重要出口基地之一。隨著醫(yī)學(xué)的不斷進(jìn)步，對(duì)用于試驗(yàn)的非人靈長類動(dòng)物的質(zhì)量要求也在不斷提高，無特定病原體(SPF)猴的需求量逐年增加，STLV病毒是SPF猴必須排除的病原之一。目前，根據(jù)貿(mào)易合同要求或輸入國家檢疫要求或途經(jīng)國家要求對(duì)進(jìn)實(shí)驗(yàn)猴必須進(jìn)行STLV1檢測(cè)；另外，Hayami M等[9]對(duì)世界各地41種靈長類動(dòng)物血清抗體的調(diào)查表明，在亞洲的獼猴中有較高的STLV-1抗體陽性率，其中恒河猴為20.4%，在猴群中進(jìn)行STLV1血清抗體檢測(cè)，是防止病毒傳播流行的有效途徑[10]。

目前，國內(nèi)有很多學(xué)者致力于STLV1血清抗體檢測(cè)方面的研究。季芳等[11]研制出了STLV1 雙抗原夾心試劑盒，用人的HTLV1 env 蛋白作為診斷抗原，臨床驗(yàn)證結(jié)果表明，存在一些假陽性反應(yīng)或非特異反應(yīng)。盧愛桃等[12]通過生物技術(shù)手段原核表達(dá)了STLV1的gag重組蛋白，作為診斷抗原建立了間接ELISA，檢測(cè)效果良好。但是ELISA方法存在一些局限：每次僅能檢測(cè)一種病毒抗體，如果需要同時(shí)檢測(cè)多種病毒抗體時(shí)，則檢測(cè)費(fèi)用較為昂貴并且費(fèi)時(shí)，完成檢測(cè)所需的樣本量較大，非常浪費(fèi)，對(duì)于一些量少的樣本就比較困難。美國VRL公司現(xiàn)已研制出對(duì)STLV1抗體進(jìn)行檢測(cè)的商品化檢測(cè)試劑盒，雖然準(zhǔn)確率較高，但價(jià)格非常昂貴且僅限于實(shí)驗(yàn)室使用，若對(duì)大量的實(shí)驗(yàn)猴的血清進(jìn)行STLV病毒抗體的監(jiān)測(cè)，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)猴養(yǎng)殖單位難以承受。ICA與傳統(tǒng)玻片法及ELISA方法相比，特異性抗原的使用克服了玻片法所用抗原質(zhì)量問題所導(dǎo)致的假陽性和假陰性問題；染色結(jié)束后的免疫梳結(jié)果直觀，肉眼即可觀察判斷，無需用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定OD值，而且該免疫梳可以長期保存以便后期復(fù)查。該方法快速、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，不需任何特殊儀器，保留了常規(guī)ELISA的敏感、特異的優(yōu)點(diǎn)，又克服了許多繁瑣的操作，節(jié)省了操作時(shí)間，縮短了實(shí)驗(yàn)周期，完全可在野外進(jìn)行實(shí)地診斷檢測(cè)，達(dá)到快速診斷的目的，能夠滿足口岸機(jī)場(chǎng)、碼頭的快速通關(guān)檢測(cè)，在基層具有良好的運(yùn)用推廣前景。