韓相敏，文 麗，高俊鋒，馬晶晶，吳碧清，賴(lài) 志，張 江，胡思順

(1.上海創(chuàng)宏生物科技有限公司，上海 松江 201619；2.浙江伊科拜克動(dòng)物保健品有限公司，上海 長(zhǎng)寧 201101；3.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)生物與生態(tài)技術(shù)系，上海 松江 201699；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070)

雞滑液支原體(Mycoplasmasynoviae,MS)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的一種重要支原體，其特征為關(guān)節(jié)、腱鞘和腳掌腫脹，并使產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量下降，蛋品質(zhì)以及孵化率降低[1]。MS可感染雞和火雞以及其他多種禽類(lèi)，呈急性或慢性經(jīng)過(guò)，多數(shù)表現(xiàn)為亞臨床癥狀的呼吸道感染以及關(guān)節(jié)炎和傳染性滑膜炎的發(fā)生，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩及胴體降級(jí)，甚至引起免疫抑制[2]。MS不僅可以通過(guò)接觸被污染的設(shè)備和空氣進(jìn)行水平傳播，同時(shí)也可以通過(guò)種蛋進(jìn)行垂直傳播[3]。Feberwee A等在對(duì)荷蘭蛋雞和肉雞進(jìn)行血清監(jiān)測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，該場(chǎng)的MS感染陽(yáng)性率表現(xiàn)為商品代雞群高于父母代，父母代高于祖代[4]，說(shuō)明垂直傳播是MS危害養(yǎng)禽業(yè)的主要方式，因此切斷MS垂直傳播對(duì)于控制MS感染，建立無(wú)MS禽群具有重要意義。

本試驗(yàn)嘗試使用藥物控制種蛋中MS的數(shù)量，探索MS凈化措施。前期研究表明，泰萬(wàn)菌素對(duì)雞滑液支原體有效，最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)為0.008 μg/mL；5～7日齡SPF雞胚感染MS后，使用50 MIC的泰萬(wàn)菌素作用5 d對(duì)MS的抑制率為70%[5]。本試驗(yàn)將MS感染15～16日齡雞胚，并對(duì)感染后雞胚注射泰萬(wàn)菌素，根據(jù)試驗(yàn)組和用藥組雞胚的健雛率及出殼雛雞肺臟MS的感染情況，確定泰萬(wàn)菌素治療雞胚中MS的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 SPF雞胚 孵化至15日齡，購(gòu)自梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 毒株 MS標(biāo)準(zhǔn)株WVU1853，試驗(yàn)前復(fù)蘇培養(yǎng)，并測(cè)定其變色單位(Color changing units,CCU)。

1.1.3 藥物制備 泰萬(wàn)菌素和泰妙菌素，均購(gòu)自浙江伊科拜克動(dòng)物保健品有限公司。使用前進(jìn)行溶解，并過(guò)濾除菌。

1.2 方法

1.2.1 MS感染 用無(wú)菌生理鹽水將制備好的支原體培養(yǎng)物稀釋至106.0CCU/0.1 mL，經(jīng)胚體接種15日齡SPF雞胚，0.1 mL/枚。同時(shí)取SPF雞胚58枚不接種MS。

1.2.2 藥物接種 接種后24 h，在接種MS的雞胚中各取32枚，分別從同一部位注射接種4 μg泰萬(wàn)菌素、0.4 μg泰萬(wàn)菌素、4 μg泰妙菌素和0.4 μg泰妙菌素作為用藥組，同時(shí)取32枚不接種藥物作為MS對(duì)照組；在不接種MS的SPF雞胚中各取12枚分別接種4 μg泰萬(wàn)菌素、0.4 μg泰萬(wàn)菌素、4 μg泰妙菌素和0.4 μg泰妙菌素作為藥物對(duì)照組，另取10枚接種生理鹽水作為空白對(duì)照組，接種后將SPF雞胚置于孵化器中繼續(xù)孵化至出殼。

1.2.3 入孵蛋健雛率統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)出殼雛的發(fā)病情況。出殼雛發(fā)病指：雛雞站立不穩(wěn)、關(guān)節(jié)腫脹、偏癱、劈叉或死亡。出殼后觀察5 d，統(tǒng)計(jì)各組雛雞健活數(shù)，比較入孵蛋健雛率(入孵蛋健雛率=健雛數(shù)/入孵數(shù)×100%)。

1.2.4 接種低劑量MS試驗(yàn) 用無(wú)菌生理鹽水將制備好的支原體培養(yǎng)物稀釋至105.0CCU/0.1 mL，并按照1.2.1～1.2.3進(jìn)行試驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)入孵蛋健雛率。

1.2.5 雛雞肺臟支原體檢測(cè) 于出殼后第5天，在接種低劑量MS的用藥組和對(duì)照組中隨機(jī)取5只雛雞，處死后取一側(cè)肺臟，分別加入1 mL培養(yǎng)基進(jìn)行勻漿，取勻漿液2 000 r/min離心2 min，取100 μL上清液加入到預(yù)先加有支原體培養(yǎng)物的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，再2倍倍比稀釋至第8孔。根據(jù)培養(yǎng)物顏色變化判定結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 接種高劑量MS試驗(yàn)結(jié)果 將支原體以106.0CCU感染雞胚，雛雞出殼后5 d，根據(jù)健活數(shù)統(tǒng)計(jì)入孵蛋健雛率，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，MS+泰萬(wàn)菌素4 μg組與MS對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，且MS+泰萬(wàn)菌素組效果優(yōu)于MS+泰妙菌素組。

表1 MS以106.0 CCU接種雞胚各組健雛率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistical results of the rate of healthy chicks in each group with inject of 106.0 CCU of MS

2.2 接種低劑量MS試驗(yàn)結(jié)果 將支原體以105.0CCU感染雞胚，小雞出殼后5 d，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，用藥組入孵蛋健雛率高于MS組，且MS+泰萬(wàn)菌素組效果優(yōu)于MS+泰妙菌素組。弱雛表現(xiàn)為劈叉、關(guān)節(jié)腫脹、無(wú)法站立。

表2 MS以105.0 CCU接種雞胚健雛率統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 2 The incubation rate of healthy chicks in each group with inject of 105.0 CCU of MS

2.3 肺臟支原體檢測(cè)結(jié)果 將各組孵出的雛雞肺臟進(jìn)行支原體檢驗(yàn)，見(jiàn)表3，MS對(duì)照組雛雞肺臟支原體含量為24.8±0.84CCU/0.1 mL，MS+藥物組雛雞肺臟支原體含量為21.6～22.0CCU/0.1 mL，低于MS組，且差異顯著(P<0.05)。

表3 雛雞肺臟支原體檢測(cè)結(jié)果Table 3 Statistical results of the content of MS in lungs

3 討論

MS在國(guó)內(nèi)流行呈逐年上升的趨勢(shì)。近幾年，山東、河南、江蘇等地包括商品蛋雞、商品肉雞、種公雞、蛋種雞等各品種、各日齡的雞均有發(fā)病[6]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，MS的流行與種蛋污染關(guān)系密切相關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為，MS對(duì)養(yǎng)殖造成的經(jīng)濟(jì)損失可能是繼2007-2008年雞淋巴細(xì)胞白血病之后，又一垂直傳播、嚴(yán)重影響?zhàn)B雞生產(chǎn)的傳染病，其造成的經(jīng)濟(jì)損失不亞于雞淋巴細(xì)胞白血病，應(yīng)引起業(yè)界的重視[7]。為了嘗試使用藥物控制MS垂直傳播，本試驗(yàn)將MS分別以106.0CCU和105.0CCU接種15日齡SPF雞胚，結(jié)果證實(shí)，用藥組入孵蛋健雛率均高于對(duì)照組，且MS+泰萬(wàn)菌素組效果優(yōu)于MS+泰妙菌素組，這表明泰萬(wàn)菌素對(duì)雞胚中的支原體有抑制作用，可以提高入孵蛋健雛率。但是由于雞胚在15～16日齡這個(gè)時(shí)期胚盤(pán)的呼吸方式由絨毛尿囊膜吸收轉(zhuǎn)為肺呼吸，處于特殊的生理時(shí)期，故此時(shí)胚胎容易死亡[8]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，藥物對(duì)照組和生理鹽水對(duì)照組雞胚出殼率較低，這可能與選擇15～16日齡開(kāi)孔并注射藥物，導(dǎo)致雞胚生理變化較大，最終影響雞胚孵化率。

MS污染種蛋孵化出的雛雞，一般發(fā)病較快，1周左右可通過(guò)接觸傳染。為了評(píng)價(jià)MS感染雛雞傳播MS的風(fēng)險(xiǎn)，試驗(yàn)中測(cè)定雛雞肺臟中MS的含量。用藥組雛雞肺臟支原體含量遠(yuǎn)低于MS對(duì)照組，表明使用泰萬(wàn)菌素對(duì)被感染的種蛋進(jìn)行治療可減少雛雞肺臟支原體含量，對(duì)種雞場(chǎng)的凈化MS具有一定的指導(dǎo)作用，盡管2種藥物均未能完全清除胚內(nèi)的MS。這可能與MS可在雞胚中快速增殖的特性和藥物的作用劑量以及藥物在胚體中的藥物動(dòng)力學(xué)有關(guān)。