李金鑫，高一丁，婁銀瑩，黃克斌，于 飛，張穎欣，于詠蘭

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis,E.faecalis)是包括犬在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物腸道共生菌，也是重要的院內(nèi)感染病原。在人醫(yī)臨床，糞腸球菌引起感染占腸球菌性感染的60%～75%[1]，常見(jiàn)感染類型包括心內(nèi)膜炎、口腔感染、創(chuàng)口感染、血液循環(huán)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)的感染[2]，近年來(lái)國(guó)內(nèi)已有動(dòng)物由糞腸球菌引起感染的病例出現(xiàn)[3-4]。腸球菌基因重組的方式較多，包括突變積累、插入序列、轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)和信息素質(zhì)粒介導(dǎo)重組等[5]，大量耐藥基因和毒力基因在種群內(nèi)得以廣泛水平傳播[6]。犬出現(xiàn)腹瀉癥狀時(shí)，多數(shù)臨床獸醫(yī)師會(huì)首選廣譜抗生素進(jìn)行治療，在英國(guó)獸醫(yī)臨床被首先給予抗生素治療的腹瀉犬比例達(dá)71%[7]，而抗生素對(duì)腸道菌群施加的選擇壓力會(huì)提高具有耐藥特性的腸球菌成為腸道優(yōu)勢(shì)菌種的可能，且腸球菌對(duì)宿主體外高滲透壓、高溫環(huán)境以及部分醫(yī)用酒精消毒劑具有較強(qiáng)的耐受性[2]，因而隨糞便排出的此類腸球菌可能引起動(dòng)物機(jī)體其他部位感染，或向包括人在內(nèi)的其他動(dòng)物水平傳播，具有公共衛(wèi)生安全隱患。本文通過(guò)研究中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集的45株腹瀉犬糞便源糞腸球菌、32株健康犬糞便源糞腸球菌的耐藥性，指導(dǎo)臨床用藥，同時(shí)采用多位點(diǎn)序列分型(Multiloucs sequence typing,MLST)方法對(duì)糞腸球菌進(jìn)行分子分型，分析不同糞便來(lái)源優(yōu)勢(shì)序列型(Sequence type,ST)糞腸球糞毒力基因攜帶情況。

1 材料與方法

1.1 對(duì)象 本試驗(yàn)用于收集糞腸球菌的犬均來(lái)源于從北京各地區(qū)至中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診或者接受疫苗免疫的犬只。腹瀉犬為有腹瀉癥狀且至少15 d內(nèi)未使用任何抗生素的犬只；健康犬為進(jìn)行免疫注射且實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查結(jié)果為正常的犬只。采集腹瀉犬、健康犬肛拭子糞便樣本，通過(guò)分離培養(yǎng)共得到腹瀉犬來(lái)源糞腸球菌45株，健康犬來(lái)源糞腸球菌32株，質(zhì)控菌株為由實(shí)驗(yàn)室保存的ATCC25922和ATCC29213。

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測(cè) 采用瓊脂稀釋法檢測(cè)糞腸球菌對(duì)抗菌藥物的最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)，檢測(cè)的抗生素包括萬(wàn)古霉素、青霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、氯霉素、呋喃妥因、高濃度慶大霉素(500 μg/mL)、紅霉素、米諾環(huán)素、多西環(huán)素、四環(huán)素、利福平，藥敏結(jié)果判讀根據(jù)美國(guó)國(guó)立臨床標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)2018年M100手冊(cè)要求。

1.2.2 DNA提取 將單菌落接種于1.5 mL LB肉湯培養(yǎng)基，37 ℃，2 500 r/min震蕩4 h，然后使用商品化的核酸提取試劑盒(Tiangen?DNA Kit)提取DNA。

1.2.3 MLST分子分型 7個(gè)管家基因(gdh、gyd、pstS、gki、aroE、xpt、yqil)的引物序列參照糞腸球菌MLST在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://efaecalis.mlst.net/misc/info.asp)由美吉生物(北京)公司合成，根據(jù)該數(shù)據(jù)庫(kù)提供的反應(yīng)體系、反應(yīng)條件對(duì)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物交由美吉生物(北京)公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳至糞腸球菌MLST在線數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，獲取每株分離菌7個(gè)管家基因等位基因編號(hào)，根據(jù)等位基因編號(hào)得出ST，并使用eBURST軟件進(jìn)行聚類分析。

1.2.4 毒力基因檢測(cè) 利用PCR檢測(cè)優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌agg、gelE、cylB、esp、efaAfs共5種毒力基因攜帶情況。以1.2.2中提取的DNA為模板，引物序列見(jiàn)表1[8]，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min；92 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，循環(huán)30次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

2 結(jié)果

2.1 糞腸球菌耐藥性 腹瀉犬源和健康犬源糞腸球菌對(duì)四環(huán)素、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、紅霉素、利福平耐藥率較高。腹瀉犬源分離株對(duì)氯霉素、氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、呋喃妥因耐藥率較低，集中于8.9%～17.8%，對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥率為0；健康犬源分離株對(duì)青霉素、呋喃妥因耐藥率較低，分別為4.8%和14.3%，對(duì)氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、萬(wàn)古霉素耐藥率為0。所有菌株的具體耐藥情況見(jiàn)表2和圖1。

表1 毒力基因及其引物Table 1 Virulence genes and primers

表2 不同來(lái)源糞腸球菌的耐藥性Table 2 Drug resistance of E.faecalis isolated from different sources

圖1 不同來(lái)源糞腸球菌的耐藥性Fig.1 Drug resistance of E.faecalis isolated from different sources

所有糞腸球菌無(wú)萬(wàn)古霉素耐藥菌株，45株腹瀉犬來(lái)源的糞腸球菌中有5株(11.1%)對(duì)5類抗菌藥物均敏感，其余分離株耐藥譜主要集中于3耐和4耐，多重耐藥率為91.1%(41/45)；32株健康犬來(lái)源糞腸球菌有8株(25.0%)對(duì)5類抗生素耐藥，其余分離株耐藥譜集中于2～4耐，多重耐藥率為75.1%(24/32)。腹瀉犬來(lái)源與健康犬來(lái)源糞腸球菌對(duì)本試驗(yàn)所選12種抗微生物藥物耐藥率差異不顯著(P>0.05)。

2.2 糞腸球菌MLST分型 45株腹瀉犬源糞腸球菌共發(fā)現(xiàn)15種ST，優(yōu)勢(shì)ST為ST116、ST16、ST179，32株健康犬源糞腸球菌發(fā)現(xiàn)18種ST，優(yōu)勢(shì)ST為ST16和ST27。ST型具體分布見(jiàn)中插彩版圖2和圖3。

通過(guò)查閱以往研究，糞腸球菌克隆復(fù)合群(Clone complex,CC)16是重要的人院內(nèi)感染病原性糞腸球菌復(fù)合群[9]，eBURST軟件分析結(jié)果顯示，腹瀉犬來(lái)源優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌中ST16、ST179共13株(24.4%，11/45)屬于CC16，健康犬來(lái)源優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌中ST16屬于CC16，數(shù)量占腹瀉犬來(lái)源分離株21.9%(7/32)。

2.3 優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌毒力基因檢測(cè) 優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。在2種來(lái)源的糞腸球菌中均檢測(cè)到agg、gelE、cylB、esp、efaAfs共5種毒力基因，16株腹瀉犬來(lái)源優(yōu)勢(shì)ST菌株中有2株不攜帶全部5種毒力基因，檢出率為87.5%(14/16)，健康犬來(lái)源優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌檢出率為75%(9/12)。不同來(lái)源糞腸球菌5種毒力基因陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)。

表3 不同來(lái)源優(yōu)勢(shì)ST型糞腸球菌毒力基因陽(yáng)性率Table 3 Prevalence of virulence genes among E.faecalis with predominant ST isolated from different sources

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外鮮有關(guān)于腹瀉犬與健康犬腸球菌耐藥情況對(duì)比的研究，Kwon K H等[10]在韓國(guó)進(jìn)行的一項(xiàng)關(guān)于健康警犬糞便中糞腸球菌的研究顯示，分離株對(duì)氨芐西林、氯霉素敏感，對(duì)紅霉素耐藥率為10%，對(duì)鏈霉素、奎奴普丁、鏈霉素耐藥率均超過(guò)80%，多重耐藥率為61.8%，氨芐西林耐藥結(jié)果和本研究相似。Leener E D等[11]采集犬臨床分離糞腸球菌，耐藥檢測(cè)結(jié)果顯示，分離株對(duì)氯霉素、高濃度慶大霉素(500 μg/mL)耐藥率分別為85%和79%，對(duì)四環(huán)素和鏈霉素耐藥率為19%和10%，多重耐藥率為34.3%，和本試驗(yàn)?zāi)退幝式Y(jié)果存在差異，表明不同地區(qū)抗生素的使用和管理策略可能會(huì)對(duì)糞腸球菌耐藥率產(chǎn)生影響。

糞腸球菌克隆復(fù)合群(Clonal complex,CC)指由某一祖先ST糞腸球菌進(jìn)化而來(lái)的所有ST糞腸球菌集合群，同一CC內(nèi)糞腸球菌遺傳進(jìn)化親緣性相近。糞腸球菌CC16以ST16糞腸球菌為祖先ST菌，是人醫(yī)臨床院內(nèi)感染病原性糞腸球菌常見(jiàn)CC。Dai D等[12]采集的重癥監(jiān)護(hù)病人感染處樣本糞腸球菌分離菌株中，CC16糞腸球菌分離率為41.7%，越南一項(xiàng)有關(guān)人醫(yī)臨床泌尿道感染病原篩查研究中，CC16糞腸球菌分離率達(dá)51.6%[13]，丹麥研究人員在患心內(nèi)膜炎人和豬的血液中均分離到CC16糞腸球菌[14]，并通過(guò)對(duì)人和豬來(lái)源CC16糞腸球菌毒力基因和毒力表型的對(duì)比發(fā)現(xiàn)2種來(lái)源分離株在致病力特性上無(wú)顯著差異，表明存在人醫(yī)臨床常見(jiàn)致病性糞腸球菌在動(dòng)物與人之間水平傳播的可能，本試驗(yàn)中腹瀉犬、健康犬來(lái)源優(yōu)勢(shì)ST糞腸球菌CC16菌株分別占24.4%和21.9%，提示犬糞便中糞腸球菌可能是人糞腸球感染病原。

在2種來(lái)源的糞腸球菌中均檢測(cè)到agg、gelE、cylB、esp、efaAfs共5種毒力基因，5種毒力基因?qū)?yīng)的陽(yáng)性率差異不顯著(P>0.05)。朱娜等[15]對(duì)湖南患流行性腹瀉、健康豬糞便中腸球菌毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，除gelE基因在健康豬源腸球菌陽(yáng)性率(9.4%)高于患流行性腹瀉豬源分離株陽(yáng)性率(2.6%)，其余包括ace、agg、cylA、efaA在內(nèi)的毒力基因PCR檢測(cè)陽(yáng)性率均表現(xiàn)為腹瀉豬糞便中分離株更高，且差異顯著(P<0.05)。吳敏[16]對(duì)人醫(yī)臨床來(lái)源和健康人來(lái)源糞腸球菌毒力基因PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，efaAfs、cylA、esp、agg、ace、gelE共6種基因在臨床源分離株中檢測(cè)陽(yáng)性率高于健康人源分離株，且esp、agg、ace、gelE陽(yáng)性率在2種來(lái)源分離株差異極顯著(P=0.00)，吳敏的研究中以人臨床感染部位分離糞腸球菌與健康人群分離糞腸球菌相對(duì)比，本試驗(yàn)中腹瀉犬糞便分離糞腸球菌可能并非是引起腹瀉的原發(fā)病原，這是腹瀉犬與健康犬糞源糞腸球菌毒力基因攜帶情況差異不顯著的可能原因。