劉耀川，高 鋒，郭首龍，李 旭，關(guān) 淼，周 維，楊洺揚，申貫?zāi)?/p>

(1.遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，遼寧 營口 115009)

豬鏈球菌(Streptococcussuis,S.suis)是一類豬群中正常攜帶的人獸共患病原微生物[1]，常見于健康豬的生殖道、消化道及上呼吸道中[2]。S.suis可引起包括豬心內(nèi)膜炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及人腦膜炎在內(nèi)的一系列化膿性炎癥[3]。豬鏈球菌血清型眾多，2型仍然是主要致病血清型，此外9型、7型、5型、CHz血清型和部分未定型菌株致病呈上升趨勢。迄今，感染人的血清型增至9種，有2型、5型、9型、14型、16型、21型、24型和31型[4-6]。其中豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2,SS2)是目前流行范圍最廣、致病性最強的血清型[7]。我國及世界范圍內(nèi)已有多起因SS2引起的豬群及人感染并死亡的報道，給生豬養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生安全造成嚴重威脅。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為臨床上治療SS2感染的主要手段之一[8]。但在藥物選擇壓力的作用下耐藥菌株不斷出現(xiàn)，給人類安全及公共衛(wèi)生造成挑戰(zhàn)。本試驗于2016-2018年，對遼寧地區(qū)14個市的19個規(guī)?；i養(yǎng)殖場開展為期3年的SS2流行病學調(diào)查，并對分離到的SS2分離株進行大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因篩查，為遼寧地區(qū)SS2大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥性分子機制研究及SS2綜合防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2016-2018年于遼寧省14個市選取規(guī)?；i養(yǎng)殖場19個，對患敗血癥、關(guān)節(jié)腫大、呼吸困難、腦炎的病死豬進行樣品采集。

1.1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptic soy agar，TSA)固體培養(yǎng)基，購自北京奧博星生物技術(shù)責任有限公司；2×TaqPCR Master Mix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD20-T vector克隆載體、DL-2 000 DNA Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；細菌基因組DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收純化試劑盒，均購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR擴增儀(T100 Thermal Cycler，BIO-RAD)、數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(Gel Dox XR+，BIO-RAD)、低溫高速臺式離心機(Biofuge Primo R，Thermo Fisher)、立式高壓滅菌器(SX700，TOMY)等儀器，均由遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.4 引物 根據(jù)NCBI中已公布的S.suis16S rRNA基因序列、SS2分型基因cps2J序列及大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因ermA、ermB、ermC及mefA序列，使用Primer 5.0設(shè)計特異性引物，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。具體引物信息見表1。

表1 SS2篩查、定型及大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因檢測引物信息Table 1 Primers information of SS2 screening,typing and macrolide drug resistance gene detection

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 無菌采集關(guān)節(jié)液、腦、心、肺等組織塊，于4 ℃無菌離心管中保存，并盡快送至遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心。

1.2.2 病原菌分離 按說明書要求無菌制備含10%脫纖維兔血的TSA固體培養(yǎng)基，待其凝固后于37 ℃過夜檢菌。在潔凈工作臺中，用鑷子取采樣組織塊，或用無菌棉拭子蘸取關(guān)節(jié)液，并均勻涂布于檢菌合格的TSA血平板中，于37 ℃倒置培養(yǎng)18 h。挑取灰白色且有溶血環(huán)的單獨小菌落于5 mL無菌營養(yǎng)肉湯中，37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。于同一病例不同組織中分離到的菌株，作為1個分離株進行統(tǒng)計。

1.2.3 基因組DNA提取及S.suis分離株鑒定 按基因組DNA提取試劑盒說明書操作要求，提取初步分離的S.suis分離株基因組DNA，并以其為模板對16S rRNA進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后回收，并與pMD20-T vector克隆載體連接，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。經(jīng)BLAST序列比對后，確定S.suis分離株。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 25 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 22 μL，體系總體積50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性40 s,可變退火溫度30 s,72 ℃延伸45 s～1 min，重復(fù)35個循環(huán)；72 ℃最終延伸7 min；4 ℃保存。

1.2.4 SS2 PCR鑒定 使用SS2定型引物，以S.suis分離株基因組DNA為模板，對SS2進行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系及條件同1.2.3。擴增產(chǎn)物經(jīng)測序、比對后，最終確定SS2分離株。

1.2.5 大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因篩查 以SS2分離株基因組DNA為模板，對其大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因攜帶情況進行PCR篩查。具體方法同1.2.3。

2 結(jié)果

2.1S.suis初步分離及SS2鑒定結(jié)果

2.1.1 樣品采集及S.suis初步分離 2016-2018年課題組于受試養(yǎng)殖場共采集發(fā)病豬、死豬樣品2 251份(2016-2018年分別為792份、626份和833份)。樣品經(jīng)TSA血液培養(yǎng)基培養(yǎng)，初步分離S.suis分離株1 851株(2016-2018年分別為622株、537株和692株)。

2.1.2S.suis分離株16S rRNA鑒定 以初步分離的S.suis分離株基因組DNA為模板，對其16S rRNA進行擴增。經(jīng)序列測定及比對，確定S.suis分離株1 159株(2016-2018年分別為391株、306株和462株)，其樣品分離率為51.5%(1 159/2 251)。2016-2018年分離率分別為49.4%(391/792)、48.9%(306/626)和55.5%(462/833)。部分S.suis分離株16S rRNA PCR擴增結(jié)果見圖1。

圖1 部分S.suis分離株16S rRNA電泳結(jié)果Fig.1 The electrophoresis results of 16S rRNA obtained from S.suisM:DL-2 000 DNA Marker；1～6:S.suis分離株M:DL-2 000 DNA Marker；1～6:S.suis isolates

2.1.3 SS2分離株分型鑒定 以經(jīng)序列比對確定為S.suis分離株的基因組DNA為模板，利用特異性引物對SS2分型基因cps2J進行PCR擴增，經(jīng)測序、比對確定SS2分離株451株(2016-2018年分別為152株、106株和193株)。SS2在S.suis分離株中占比及樣品分離率分別為38.9%(451/1 159)和20.0%(451/2 251),2016-2018年占比及樣品分離率分別為38.9%(152/391)、19.2%(152/792)；34.6%(106/306)、16.9%(106/626)；41.8%(193/462)和23.2%(193/833)。部分cps2J基因PCR擴增結(jié)果見圖2。

圖2 部分SS2分型基因cps 2J電泳結(jié)果Fig.2 The electrophoresis results of cps 2J gene obtained from SS2M:DL-2 000 DNA Marker；1～4:cps2J基因M:DL-2 000 DNA Marker；1～4:cps2J gene

2.2 大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因篩查結(jié)果

2.2.1 分離株耐藥基因攜帶情況 在451株SS2分離株中，共有255株攜帶不同類型的大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因，菌株陽性率為56.5%(255/451)。其中234株為僅攜帶1種耐藥基因的菌株，占比51.9%(234/451)；21株分離株同時攜帶2種耐藥基因，占比4.7%(21/451)；未發(fā)現(xiàn)同時攜帶3種及3種以上耐藥基因的分離株。

共有87株分離株僅攜帶ermA基因，占比19.3%(87/451)；66株分離株僅攜帶ermB基因，占比14.6%(66/451)；81株分離株僅攜帶mefA基因，占比18.0%(81/451)；16株分離株同時攜帶ermA和mefA基因，占比3.5%(16/451)；5株分離株同時攜帶ermB和mefA基因，占比1.1%(5/451)。

2.2.2 耐藥基因篩查 篩查共獲得大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因276個，其中ermA、ermB和mefA基因占比分別為37.3%(103/276)、25.7%(71/276)和37.0%(102/276)，未檢測到ermC基因。

按年份分析ermA、ermB和mefA基因篩查結(jié)果，2016年上述3種基因的占比分別為41.2%(42/102)、22.5%(23/102)和36.3%(37/102)；2017年為33.6%(27/80)、23.8%(19/80)和42.5%(34/80)；2018年為36.2%(31/94)、30.9%(29/94)和33.0%(31/94)。具體耐藥基因篩查結(jié)果見表2。部分耐藥基因PCR擴增結(jié)果見圖3。

表2 耐藥基因篩查結(jié)果Table 2 The screening results of drug resistance gene

圖3 部分大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因電泳結(jié)果Fig.3 The electrophoresis results of some macrolides resistance geneM:DL-2 000 DNA Marker；1～2:ermA基因；3～4:ermB基因；5～6:mefA基因M:DL-2 000 DNA Marker；1～2:ermA gene；3～4:ermB gene；5～6:mefA gene

3 討論

目前SS2是世界范圍內(nèi)主要流行的血清型，作為健康豬的常在病原菌，其對生豬養(yǎng)殖業(yè)及從業(yè)人員的健康造成嚴重威脅。近年來，已有多例人感染SS2引起死亡的病例報道，SS2已成為重要的公共衛(wèi)生安全隱患[9-11]。本試驗對遼寧地區(qū)19個規(guī)?；i養(yǎng)殖場進行3年的SS2流行病學調(diào)查，結(jié)果表明，SS2占總分離S.suis的38.9%。近期報道中，該分離率為10.0%～53.3%不等。如徐引弟等[7]于2016年對河南地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SS2占總S.suis分離株的46.0%；趙戰(zhàn)勤等[5]于2011-2015年對河南及周邊省份進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SS2占總S.suis分離株的53.3%；劉琪等[12]廣東地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SS2占比為16.58%；王娟等[9]在廣州地區(qū)健康豬群中調(diào)查發(fā)現(xiàn)，S.suis攜帶率為33.81%，其中SS2占比8.82%；徐魁等[8]對四川地區(qū)SS2進行流行病學調(diào)查，結(jié)果表明，四川地區(qū)SS2總體陽性率為40.3%，81.8%的受調(diào)查規(guī)?；B(yǎng)殖場均為SS2陽性；楊春蕾等[13]在天津地區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SS2的樣品陽性率為3.5%；董志民等[14]對我國多地區(qū)流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SS2占比為24.4%。本試驗結(jié)果與報道數(shù)據(jù)相比，在樣品分離率及在總S.suis分離株中占比均屬于相對較高水平，表明遼寧地區(qū)規(guī)?；i養(yǎng)殖場中SS2流行情況相對較高。

本試驗對451株SS2分離株4種大環(huán)內(nèi)酯類藥物耐藥基因攜帶情況進行篩查，結(jié)果表明，共有103株(87株僅攜帶ermA基因及16株同時攜帶ermA、mefA基因)為ermA基因陽性株，占比22.8%(103/451)；71株(66株僅攜帶ermB基因及5株同時攜帶ermB、mefA基因)為ermB基因陽性株，占比15.7%(71/451)；102株(81株僅攜帶mefA基因及21株同時攜帶2種耐藥基因)為mefA陽性株，占比22.6%(102/451)，未檢出ermC基因。孫佳楠等[15]報道，在遼寧西部豬源SS2中，ermA、ermB、ermC和mefA基因的檢出率分別為53.3%、76.1%、0%和5.43%；芮萍等[16]報道，河北地區(qū)豬源SS2ermB、ermA檢出率分別為98.0%和25.5%，未檢出mefA基因；黃金虎等[11]對江蘇、江西等地調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其ermB、mefA基因陽性率分別為26.1%和8.7%。與報道數(shù)據(jù)比較，受試飼養(yǎng)場SS2分離株在耐藥基因種類及陽性率方面均有所不同，可能與地區(qū)間用藥習慣、治療方案不同有關(guān)，同時不同地區(qū)病原菌間耐藥性傳遞機制差異也可能對耐藥基因攜帶結(jié)果存在影響。