董曉澤,徐書敏,王麗君,趙 越,王世光,唐云平,余方苗,丁國芳
(浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院,浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心,浙江舟山 316022)
免疫系統(tǒng)是人體的重要系統(tǒng)之一,它能有效的防止病菌入侵,維持機體健康[1-2]。免疫系統(tǒng)功能低下會降低人對疾病的抵抗能力,造成容易感染、生病等。巨噬細胞是研究免疫調(diào)節(jié)常用的細胞種類之一,它在免疫系統(tǒng)中扮演十分重要的角色,它可以激活其它免疫細胞,并且有噬菌作用。因此,研究藥物對巨噬細胞增殖的影響十分重要。
生物活性肽(bioactive Peptides,BAP)是指對機體具有積極效果的肽類化合物。研究顯示,生物活性肽具有降低血壓血脂、抗菌以及免疫調(diào)節(jié)等作用[3-4]。目前廣泛應用的生物活性肽的制備方法主要有三種:化學溶劑萃取、微生物工程發(fā)酵和酶促水解。用內(nèi)肽酶和外肽酶水解生物蛋白來獲得生物活性肽的方法被稱為酶水解法[5-6],酶水解提取法反應條件溫和、安全無毒,因此成為食品及醫(yī)藥品行業(yè)的首選方法。不同的蛋白酶酶解同種蛋白的酶解產(chǎn)物的功能性質(zhì)不同,蛋白酶的選擇是采用酶解法制備生物活性肽的關鍵[7-9]。葉盛旺等[10]從青蛤中酶解提取的青蛤多肽具有激活巨噬細胞增強機體免疫力的作用;劉倩茹等[11]通過酶解法從北太平洋魷魚纏卵腺中提取了具有抗氧化活性的寡肽。宋茹等[12]利用中性蛋白酶從魷魚中提取了魷魚蛋白抗氧化肽。由此可見,酶水解法在提取生物活性肽領域中應用廣泛。
日本黃姑魚Nibea japonica 俗稱黑毛鲿,主要分布于我國的東南部海和日本海南部區(qū)域[13-14]。目前的報道中對日本黃姑魚的研究多集中于養(yǎng)殖與運輸方面,關于日本黃姑魚魚皮免疫活性肽的研究報道較少,柴學軍等[15]研究了鹽度和溫度對日本黃姑魚胚胎發(fā)育的影響;孫敏等[16]研究了在發(fā)育早期的日本黃姑魚體內(nèi)消化酶的活性;孫鵬等[17]研究了運輸脅迫對日本黃姑魚肝臟抗氧化能力的影響。然而,在食品加工過程中(如制作魚丸) 會產(chǎn)生許多副產(chǎn)品,如魚皮、魚骨等,這些物料可用作免疫活性肽的提取原料。YU Fangmiao,et al[18]研究了日本黃姑魚魚皮膠原蛋白的提取方法與溶解性;TANG Yunping,et al[19]研究了日本黃姑魚魚皮膠原蛋白在化妝品中應用的可能性。因此,本實驗采用酶促水解法,以小鼠巨噬細胞RAW 264.7 的相對增殖率為評價指標進行最優(yōu)酶種篩選,再經(jīng)單因素實驗和響應面分析法確定日本黃姑魚魚皮酶解工藝,以期為制備日本黃姑魚魚皮膠原蛋白肽和進一步研究其免疫活性提供理論依據(jù)。
日本黃姑魚:由浙江省海洋水產(chǎn)研究所提供。蛋白酶:北京亞太恒信生物科技有限公司。Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)高糖培養(yǎng)基:Gibco 公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO):Sigma 公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。小鼠單核巨噬細胞RAW 264.7:于中科院上海細胞所購買,由本實驗室傳代培養(yǎng)。
超純水儀:美國Millipore 公司;高速低溫離心機:日本日立公司;冷凍干燥機:德國CHRIST 公司;超凈工作臺:上海智誠分析儀器制造公司;CO2培養(yǎng)箱:美國Thermo 公司;倒置顯微鏡:日本OLYMPUS 公司;酶標儀:美國Bio-Rad 公司等。
1.2.1 日本黃姑魚魚皮免疫調(diào)節(jié)肽制備流程
日本黃姑魚→取魚皮→異丙醇脫脂→NaOH 去除雜蛋白→酶解→冷凍干燥→日本黃姑魚魚皮免疫調(diào)節(jié)肽。
1.2.2 日本黃姑魚魚皮預處理
將500 g 魚皮用自來水清洗干凈,剪成1 cm×2 cm 大小,異丙醇5 000 mL 脫脂24 h,用純水將魚皮洗至無異丙醇味;0.1 mol·L-1NaOH 溶液5 000 mL 去除雜蛋白24 h,用純水洗至中性,將魚皮放置于-20 ℃冰箱冷凍備用。
1.2.3 最優(yōu)酶種的選擇
稱量5 g 日本黃姑魚魚皮,按最適pH 和溫度[20]分別將胃蛋白酶(pH 2.0,37 ℃)、木瓜蛋白酶(pH 6.0,60 ℃)、中性蛋白酶(pH 7.0,45℃)、胰蛋白酶(pH 8.0,37 ℃)、堿性蛋白酶(pH 10.0,45 ℃) 5 種蛋白酶進行酶解反應。所用蛋白酶的量均為1 500 U·g-1、液料比(純水與魚皮的比例)10:1(mL·g-1),時間為6 h。采用MTT 比色法[21]檢測各酶制備的產(chǎn)物對巨噬細胞RAW 264.7 增殖的影響,按照式(1)計算巨噬細胞RAW 264.7 相對增殖率,并以其為指標,篩選最優(yōu)酶種。
實驗組OD490為給藥后的細胞上清液吸光度;空白對照組OD490為相同時間未給藥的細胞上清液吸光度。
1.2.4 單因素實驗
稱量5 g 日本黃姑魚魚皮,使用1.2.3 中最優(yōu)酶種,選取pH、溫度、時間、加酶量、液料比5 個影響酶解過程的主要因素進行單因素實驗,單因素水平表見表1。以巨噬細胞RAW 264.7 相對增殖率為評價指標,考察各因素對酶解產(chǎn)物活性的影響。
表1 單因素水平表Tab.1 Factor and levels
1.2.5 響應面實驗
在1.2.4 單因素實驗的基礎上,用軟件Design Expert V8.0.6 建立響應面實驗,探求日本黃姑魚魚皮酶解最佳工藝。以巨噬細胞RAW 264.7 相對增殖率(Y/%)為考察指標,酶解溫度(A),酶解時間(B)及液料比(C)為自變量,響應面實驗因素水平編碼見表2。
表2 響應面實驗因素水平表Tab.2 Factor and Levels in response surface experiment
1.2.6 細胞培養(yǎng)
參照葉盛旺等[20]巨噬細胞RAW 264.7 的培養(yǎng)方法培養(yǎng)細胞并傳代,選擇對數(shù)生長期的細胞用于實驗。
由圖1 得知,5 種商業(yè)蛋白酶中,中性蛋白酶制備的酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細胞相對增殖率最高(41.53%)。因此選擇中性蛋白酶為最優(yōu)酶種。
2.2.1 pH 單因素實驗結(jié)果
由圖2 得知,在pH 5~9 之間,酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細胞相對增殖率的變化不大,pH 為7 時達到最大值(46.84%),可能由于酶的活性會隨著pH 的改變而改變,最終導致酶解產(chǎn)物活性的改變。最終選定酶解pH 為7。
圖1 5 種酶解產(chǎn)物對RAW 264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.1 Effects of five enzymatic hydrolysates on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells
圖2 pH 對RAW 264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.2 Effect of pH on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells
2.2.2 溫度單因素實驗結(jié)果
由圖3 得知,在35~45 ℃,酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細胞相對增殖率顯著提高,45 ℃時達到最大值(44.40%),之后,隨著溫度的增長,相對增殖率明顯下降。最終選定酶解溫度42.5~47.5 ℃進行響應面實驗。
2.2.3 時間單因素實驗結(jié)果
由圖4 得知,在2~6 h 之間,酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細胞相對增殖率顯著提高,6 h 時達到最大值(47.19%),之后,隨著時間的增長,相對增殖率減小。最終選定酶解時間5~7 h 進行響應面實驗。
圖3 溫度對RAW 264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.3 Effect of temperature on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells
圖4 時間對RAW 264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.4 Effect of time on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells
2.2.4 加酶量單因素實驗結(jié)果
由圖5 得知,在加酶量為1 500 U·g-1時,酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細胞相對增殖率達到最大值(53.86%),之后,隨著加酶量的增長,相對增殖率減小。最終選定酶解時的加酶量為1 500 U·g-1。
2.2.5 液料比單因素實驗結(jié)果
由圖6 得知,在液料比為10:1 (mL·g-1)時,酶解產(chǎn)物作用下的RAW 264.7 細胞相對增殖率達到最大值(49.38%),之后,隨著液料比的增長,相對增殖率減小。最終選定液料比9:1~11:1 (mL·g-1)進行響應面實驗。
圖5 加酶量對RAW 264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.5 Effect of enzyme amount on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells
圖6 液料比對RAW 264.7 細胞相對增殖率的影響Fig.6 Effect of liquid/solid ratio on the relative proliferation rate of RAW 264.7 cells
2.3.1 響應面實驗設計與結(jié)果及方差分析
根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取酶解時間、溫度及液料比3 個因素進行響應面實驗,設計及結(jié)果如表3 所示。
表3 響應面實驗設計與結(jié)果Tab.3 Respond surface experimental design and results
回歸模型方程:Y=14.77-9.08A+0.76B-3.39C-8.95AB-2.26AC-10.03BC+31.41A2-16.20B2+17.95C2
該模型的回歸方程的方差分析結(jié)果如表4 所示。擬合模型的F 值為16.28,對應P<0.01,表明所得模型較顯著。且該模型中誤差失擬項P>0.05,模型失擬不顯著,表明該擬合方程與實驗的擬合度較高,比較可靠。應用該回歸模型能夠?qū)换ヒ蛩刂苽涞娜毡军S姑魚魚皮酶解物對RAW264.7 細胞的相對增殖率進行分析和預測。
表4 模型回歸方程方差分析Tab.4 ANOVA of regression equation
該模型的各交互因素的F 值被用于評價其對于實驗評價指標的影響程度,更大的F 值說明該因素對RAW264.7 細胞的相對增殖率影響越大。由表4 可知,F(xiàn)(A)=62.34,F(xiàn)(B)=0.13,F(xiàn)(C)=8.44,即各因素對相對增殖率的影響順序為時間>液料比>溫度。
2.3.2 交互作用影響結(jié)果
響應面曲面的傾斜程度表示該因素對相對增殖率影響的強度;響應曲面傾斜程度越弱,說明其越可容忍該因素的影響[22]。等高線圖中曲線形狀表示2 個變量間的交互作用程度,越是趨近于橢圓形,交互程度越高,趨近于圓形則交互程度越低[23]。
由圖7a、b 得知,在所考察的酶解溫度和液料比范圍內(nèi),相對增殖率有先增大后減小的趨勢,且有極大值;相對增殖率隨時間的增大而增大。另外,由等高線圖可知,時間等高線更陡峭。由此可以推測時間對相對增殖率的影響大于液料比和溫度。由圖7c 得知,在液料比和溫度等高線中,等高線沿液料比軸變化的趨勢明顯高于溫度軸,說明液料比對相對增殖率的影響較溫度大。
圖7 響應面和等高線圖Fig.7 Responsive surfaces and contour plot
2.3.3 最佳提取條件及驗證
由Design-Expert V8.0.6 軟件分析得最佳酶解工藝是:提取時間5.52 h,溫度45.27 ℃,液料比為9.82:1(mL·g-1)??紤]到實際應用過程中操作方便,將工藝條件修正為提取時間5.5 h,溫度45.5 ℃,液料比為10:1(mL·g-1)進行驗證性實驗。此條件下的理論提取率為57.80%。通過3 次平行試驗,測得最佳條件下相對增殖率為57.47%,相對誤差為0.57%,與理論提取率無顯著性差異。表明應用響應面法模擬的模型及最佳條件可靠。
本實驗得到中性蛋白酶的最佳酶解條件是pH 為7,溫度45.5 ℃,時間5.5 h,加酶量1 500 U·g-1,液料比10:1 (mL·g-1),在此工藝下所得日本黃姑魚魚皮酶解產(chǎn)物刺激RAW 264.7 的相對增殖率為57.47%。該工藝為制備日本黃姑魚魚皮酶解多肽的及進一步研究其免疫調(diào)節(jié)活性提供了依據(jù)。