徐 丹，郭遠(yuǎn)明，李鐵軍，張玉榮

（1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021）

石油類(lèi)是成分十分復(fù)雜的混合物，含有烷烴、環(huán)烷烴、芳香烴等多種難以降解的有害物質(zhì)[1-2]。當(dāng)海水被石油污染時(shí)，會(huì)影響海洋生物的攝食、生長(zhǎng)和繁殖，改變魚(yú)類(lèi)的洄游路線(xiàn)，沾污漁具和漁獲物，影響水產(chǎn)品質(zhì)量，最終危害人體健康[3-5]。隨著石油及其產(chǎn)品在開(kāi)采、煉制、貯運(yùn)和使用過(guò)程中進(jìn)入海洋，通過(guò)各種途徑進(jìn)入海洋的石油類(lèi)化合物總量不斷增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從20 世紀(jì)70 年代到21 世紀(jì)初，全球大約有56.59×104t 石油排入海洋中，我國(guó)每年約10×104t 石油直接排入近海[6]，大量石油入海導(dǎo)致海洋生物多樣性指數(shù)降低，海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)失衡，漁業(yè)資源的質(zhì)量和產(chǎn)量下降嚴(yán)重[7-8]，1971-2011 年，我國(guó)50 t 以上海洋溢油事故共發(fā)生81 起，溢油總量為49 667 t，污染物種類(lèi)主要為燃油、原油和柴油?！笆の濉逼陂g我國(guó)石油需求量仍然巨大，沿海石油運(yùn)輸量也將日益增加，海洋溢油風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生概率逐漸增大。海洋溢油事故發(fā)生后，其影響范圍和程度往往是巨大的，通常會(huì)導(dǎo)致溢油事故發(fā)生地周邊海域生態(tài)環(huán)境和漁業(yè)資源受到嚴(yán)重破壞，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9]。因此，開(kāi)展入海石油污染物的修復(fù)治理研究對(duì)保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境和促進(jìn)海洋經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

海洋生物修復(fù)技術(shù)是指利用特定的生物（植物、微生物或其他動(dòng)物）吸收、轉(zhuǎn)化、清除或降解環(huán)境污染物，使環(huán)境中的有害污染物通過(guò)降解或其他途徑得以去除，實(shí)現(xiàn)環(huán)境凈化、生態(tài)效應(yīng)恢復(fù)的生物措施。與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)處理方法相比，具有現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)、不產(chǎn)生二次污染、時(shí)間短、經(jīng)費(fèi)低、對(duì)人體健康和環(huán)境影響小等優(yōu)點(diǎn)[10]，在重金屬污染、有機(jī)物污染、石油污染等幾種主要海洋污染中得到廣泛的研究和應(yīng)用。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在微生物和微藻對(duì)海洋石油污染的生物修復(fù)研究方面取得了較多成果[11-14]，但未見(jiàn)大型海藻對(duì)石油烴的降解技術(shù)研究，本文初步探討了海帶Laminaria japonica、裙帶菜Undaria pinnatifida、帶形蜈蚣藻Grateloupia turuturu 和孔石莼Ulva lactuca 等4 種大型海藻對(duì)石油烴的降解效果及石油烴對(duì)大型海藻超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的影響，篩選出對(duì)石油污染具有較好去除效果的大型藻類(lèi)，為利用大型海藻治理海洋石油污染提供技術(shù)依據(jù)，拓展海洋石油污染治理的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

帶形蜈蚣藻購(gòu)買(mǎi)于普陀區(qū)東河市場(chǎng)，孔石莼采集于舟山海域，海帶和裙帶菜采集于嵊泗枸杞島，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室經(jīng)海水反復(fù)清洗去除泥沙及雜質(zhì)后，置于溫度12±1 ℃、鹽度27、pH 7.8 水箱中培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5 d后，選取生長(zhǎng)健壯、形態(tài)較一致的藻體用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 石油烴母液

在避光條件下，室溫下按照1：9 的體積比將經(jīng)過(guò)過(guò)濾滅菌的海水與加油站購(gòu)買(mǎi)的0#柴油混合，之后經(jīng)超聲震蕩器處理6 h，然后將混合液倒入分液漏斗中靜置5 h，最后將分離出的石油烴母液于4 ℃避光保存，石油烴母液濃度的測(cè)定按照海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范（GB17378.4-2007）中石油醚萃取熒光分光光度法進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)時(shí)按設(shè)置濃度對(duì)母液進(jìn)行稀釋。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)置0.8、1.7、2.6、3.6、4.5 mg·L-15 個(gè)濃度，以飽和石油烴作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)在容積為2 L 的燒杯中進(jìn)行，每個(gè)燒杯實(shí)驗(yàn)用水體積為1.6 L，每個(gè)燒杯中放入大型海藻10.0 g 左右。每個(gè)實(shí)驗(yàn)處理組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)周期5 d，于實(shí)驗(yàn)的第1、2、3、4、5 d 取3 個(gè)平行樣測(cè)定超氧化物歧化酶（SOD），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取培養(yǎng)水測(cè)量石油烴含量和大型藻濕重。

1.4 SOD 的測(cè)定

選擇新鮮藻體取樣0.3 g，經(jīng)液氮研磨成勻漿狀，然后加入提取液5 mL （pH 7.0、50 mmol·L-1H3PO4緩沖液；1% PVP 0.1%；Triton X-100）[15]，離心取上清液作為待測(cè)溶液。SOD 的測(cè)定使用南京建成生物工程研究所試劑盒，采用羥胺法測(cè)定SOD 活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

SOD 測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean±SD）表示，采用SPSS17.0 數(shù)據(jù)處理軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，石油烴脅迫引起的顯著差異用單因素方差分析法（ANOVA） 分析，當(dāng)顯著性水平P＜0.05 時(shí)為顯著性差異，P＜0.01 時(shí)為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大型海藻濕重變化

大型海藻在不同濃度石油烴中生長(zhǎng)濕重變化結(jié)果如表1?？梢钥闯觯蛯?duì)照相比，在1.7 mg·L-1濃度以下，海帶和裙帶菜濕重都有一定程度的增長(zhǎng)，葉片健康無(wú)腐爛，1.7 mg·L-1以上增長(zhǎng)率為負(fù)值且逐漸降低，葉片有腐爛現(xiàn)象。全部濃度石油烴中帶形蜈蚣藻和孔石莼濕重均低于對(duì)照，隨著石油烴濃度的升高，濕重降低程度越高，葉片損傷越嚴(yán)重。綜上可知，海帶和裙帶菜在低于1.7 mg·L-1的石油烴中生長(zhǎng)良好。

表1 大型海藻在不同濃度石油烴中濕重增長(zhǎng)率Tab.1 The wet weight growth rate of macroalgae in WAF with different concentrations

2.2 大型海藻對(duì)不同濃度石油烴的降解率

大型海藻對(duì)不同濃度石油烴的降解率如表2?？梢钥闯觯?.6 mg·L-1處理組的海帶、裙帶菜外，海帶、裙帶菜、帶形蜈蚣藻和孔石莼等4 種大型海藻對(duì)石油烴的降解率均隨濃度的增加而逐漸降低，其中海帶和裙帶菜對(duì)低于1.7 mg·L-1的石油烴具有較好的降解效果，海帶對(duì)石油烴的降解率為76.3%～81.3%，裙帶菜對(duì)石油烴的降解率為82.2%～87.5%，海帶和裙帶菜對(duì)石油烴的降解效果遠(yuǎn)好于帶形蜈蚣藻和孔石莼。

表2 大型海藻對(duì)不同濃度石油烴的降解率Tab.2 The degradation rate of WAF with different concentrations of macroalgae

2.3 不同濃度石油烴對(duì)大型海藻SOD 活性的影響

2.3.1 不同濃度石油烴對(duì)海帶SOD 活性的影響

海帶SOD 的酶活性結(jié)果如圖1 所示。低濃度（0.8、1.7 mg·L-1）各處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前4d 內(nèi)均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），至5 d 時(shí)0.8 mg·L-1處理組基本恢復(fù)至最初水平，1.7 mg·L-1處理組仍極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；中濃度（2.6 mg·L-1）處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)1 d 時(shí)極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），2～5 d 時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；高濃度3.6 mg·L-1處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前2 d 內(nèi)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），3～5 d 時(shí)極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。4.5mg·L-1處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前2 d 時(shí)與對(duì)照差不多，3～5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.3.2 不同濃度石油烴對(duì)裙帶菜SOD 活性的影響

裙帶菜SOD 的酶活性結(jié)果如圖2 所示，與不同濃度石油烴對(duì)海帶SOD 活性的影響相似。低濃度0.8 mg 處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前4 d 內(nèi)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），低濃度1.7 mg·L-1處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前4 d 內(nèi)均極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），至5 d 時(shí)各處理組基本恢復(fù)至最初水平；中濃度2.6 mg·L-1處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前3 d 時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），4～5 d 時(shí)極顯著高于對(duì)照組（P＜0.01）；高濃度3.6 mg·L-1處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前2 d 時(shí)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），3 d 時(shí)與對(duì)照差不多，4～5 d 時(shí)極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。高濃度4.5 mg·L-1處理組的SOD 活性在實(shí)驗(yàn)前3 d時(shí)與對(duì)照差不多，4～5 d 時(shí)極顯著低于對(duì)照組（P＜0.01）。

圖1 海帶在不同濃度石油烴中培養(yǎng)后的SOD（U·mg-1prot）Fig.1 SOD of L.japonica cultivated in WAF with different concentrations

3 討論

圖2 裙帶菜在不同濃度石油烴中培養(yǎng)后的SOD（U·mg-1prot）Fig.2 SOD of U.pinnatifida cultivated in WAF with different concentrations

SOD 是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，廣泛分布于微生物、植物、動(dòng)物等各種生物體內(nèi)，是生物體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，提高生物體抗氧化能力。在外界環(huán)境脅迫下，植物體內(nèi)氧自由基如超氧化合物陰離子自由基的產(chǎn)量會(huì)增加[16]。已有研究成果表明，當(dāng)藻類(lèi)受到外界污染脅迫時(shí)，會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除的平衡，導(dǎo)致自由基累積，加劇細(xì)胞膜脂過(guò)氧化[17]。本文研究結(jié)果表明，不同濃度的石油烴脅迫對(duì)藻類(lèi)SOD 活性的影響不同，低濃度（≤1.7 mg·L-1）脅迫下前4 d 對(duì)海帶、裙帶菜的SOD 活性均有明顯的促進(jìn)作用，而隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，至5d 時(shí)SOD 活性基本恢復(fù)到對(duì)照組水平；中濃度（2.6 mg·L-1）脅迫下對(duì)海帶、裙帶菜的SOD 活性均有明顯的促進(jìn)作用，5 d 時(shí)仍顯著高于對(duì)照組；高濃度（≥3.6 mg·L-1）脅迫下4～5 d 時(shí)SOD 活性處于較低水平，顯著低于對(duì)照組。原因可能是：在低濃度石油烴脅迫下，海帶、裙帶菜對(duì)外來(lái)干擾做出應(yīng)急防御，提高了藻細(xì)胞活性氧（ROS）的產(chǎn)生速率，從而快速激發(fā)更多的SOD 來(lái)清除活性氧，將超氧化物歧化為過(guò)氧化氫，隨著脅迫時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除達(dá)到平衡，SOD 活性基本恢復(fù)至最初水平。在中濃度石油烴脅迫下，藻細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝機(jī)制的平衡被打破，導(dǎo)致活性氧在藻細(xì)胞內(nèi)大量累積，顯著提高了SOD 活性，對(duì)藻體起到一定的保護(hù)作用。在高濃度石油烴脅迫下，4～5 d 時(shí)海帶、裙帶菜體內(nèi)的SOD 活性反而下降，可能因石油烴降解率較低，藻體的SOD 活性下降來(lái)避免自身?yè)p傷或者生物體已經(jīng)受到脅迫損傷導(dǎo)致SOD 下降，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

（1）海帶和裙帶菜在低濃度（≤1.7 mg·L-1）的石油烴中生長(zhǎng)良好，并且對(duì)石油烴具有較好的降解效果，海帶對(duì)石油烴的降解率為76.3%～81.3%，裙帶菜對(duì)石油烴的降解率為82.2%～87.5%。

（2）在低濃度（≤1.7 mg·L-1）時(shí)石油烴雖然會(huì)導(dǎo)致海帶和裙帶菜體內(nèi)的SOD 活性升高，但最終會(huì)恢復(fù)到正常范圍，是一種可逆的損傷，高濃度的石油烴會(huì)對(duì)海帶和裙帶菜造成不可逆的生物損傷。

（3）海帶和裙帶菜可作為低濃度（≤1.7 mg·L-1）石油污染的降解生物，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。