廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院（510240）童巧勤

肝臟纖維化是肝臟自身對(duì)一系列慢性刺激作出的自我修復(fù)反應(yīng)，目前已知肝臟纖維化的中心環(huán)節(jié)是肝星狀細(xì)胞的增殖與活化[1]?，F(xiàn)有研究表明，姜黃素促進(jìn)肝臟星狀細(xì)胞的凋亡從而起到抗肝纖維化的目的，其主要可能機(jī)制是姜黃素能夠抑制星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白α1的表達(dá)以及其他一系列的信號(hào)通路的改變，其中較為重要的是髓樣分化因子88（MyD88）依賴性信號(hào)通路，而MyD88是該信號(hào)通路中的一項(xiàng)重要蛋白[2]。而MyD88是否在姜黃素抑制星狀細(xì)胞的凋亡過程中起到一定作用，目前尚未可知，本研究即探究MyD88對(duì)姜黃素抑制星狀細(xì)胞的凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 基本資料 本次研究所用到的主要試劑與材料有肝星狀細(xì)胞株HSC-T6、姜黃素、MyD88 siRNA、特級(jí)新生小牛血清、胰蛋白酶、MyD88抗體、一抗二抗剝脫液等。其來源統(tǒng)計(jì)如附表1。

1.2 方法 細(xì)胞培養(yǎng)：采用大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，細(xì)胞株培養(yǎng)在含 100 U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37℃，含有5%CO2。以下所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

細(xì)胞傳代：待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長至約90%融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，倒掉培養(yǎng)液后，向瓶內(nèi)加入1ml消化液（0.25%胰蛋白酶）輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，然后倒掉消化液，再加入1ml新的消化液，輕輕搖動(dòng)后再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化。消化2～5分鐘后把培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大后，立即加入含血清的培養(yǎng)液終止消化。用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，使之成為單細(xì)胞懸液。將得到的細(xì)胞懸液分瓶培養(yǎng)。按照1∶2比例傳代。

MyD88及姜黃素處理：將培養(yǎng)的HSC-T6細(xì)胞分為對(duì)照組、MyD88組、姜黃素組、MyD88+姜黃素組，采用MyD88 siRNA對(duì)MyD88組、MyD88+姜黃素組進(jìn)行干擾，48h后再加入姜黃素進(jìn)行干擾24h。

1.3 指標(biāo)檢查方法 Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)：采用胰酶消化離心生長至對(duì)數(shù)期的HSC-T6細(xì)胞細(xì)胞，并加入細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打細(xì)胞混液使裂解液充分作用，30min后對(duì)其進(jìn)行離心取上清液，Bradford法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白定量處理，取上清液0.05ml與0.1mlSDS混勻后再加入4倍體積的PBS溶液，加熱至沸騰變性；將變性蛋白進(jìn)行凝膠電泳處理后用5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1h，加入已孵育好的一抗，過夜，洗膜，加入二抗后孵育120min，顯影，最后用Quantity One4.6.2軟件分析目的條帶的灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度值的比值，作為目的蛋白的相對(duì)量，用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。將每小組3個(gè)樣本的對(duì)應(yīng)結(jié)果計(jì)算后，取平均值。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：取相同量的細(xì)胞混懸液，離心5min（1200r/min）后棄上清液，向各組中分別加入200μl的PBS溶液并輕輕混勻，然后依次加入AnnexinV-FITC染液和碘化丙啶(PI)各2μl，混勻后于37攝氏度溫箱內(nèi)孵育15min，結(jié)束后加入200μl的PBS溶液上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0分析，計(jì)量資料采用t值檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)比較卡方x2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

附表1 實(shí)驗(yàn)材料及來源統(tǒng)計(jì)表

附表2 四組細(xì)胞的MyD88表達(dá)水平對(duì)比

附表3 四組細(xì)胞的凋亡率對(duì)比

2 結(jié)果

2.1 四組細(xì)胞之間的MyD88表達(dá)水平MyD88組灰度比值為（0.472±0.022），姜黃素組灰度比值為（0.585±0.037），M y D 8 8+姜黃素組灰度比值為（0.184±0.039）、對(duì)照組灰度比值為（0.968±0.085），四組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較見附表2。

2.2 四組細(xì)胞凋亡率比較 MyD88組凋亡率為（8.389±1.131），姜黃凋亡率為（27.185±6.032），MyD88+姜黃素組凋亡率為（40.286±10.029）、對(duì)照組灰度比值為（7.927±1.025），四組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較見附表3。

3 討論

肝星狀細(xì)胞是肝纖維化過程中的關(guān)鍵細(xì)胞，而姜黃素具有良好的抗肝纖維化作用，目前對(duì)其作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚處于理論階段，主要認(rèn)為與以下幾點(diǎn)關(guān)系密切：①姜黃素能降低多種膠原（Ⅰ～Ⅳ型）的表達(dá)同時(shí)能促進(jìn)這些膠原的降解；②姜黃素可以抑制TIMP-1的表達(dá)，該因子的主要作用是促肝纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)；③姜黃素能促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡[3][4]。其中促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的凋亡是其發(fā)揮主要可能機(jī)制是姜黃素能夠抑制星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白α1的表達(dá)以及其他一系列的信號(hào)通路的改變，Toll樣受體通路（TLR）占主要作用。目前主要認(rèn)為TLR激活后能夠?qū)е翹F-κB活化，而在TLR活化NF-κB的過程中，最主要的作用物質(zhì)是MyD88。本研究即從此出發(fā)探究MyD88對(duì)姜黃素促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡效果的影響。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用MyD88 siRNA、姜黃素、MyD88+姜黃素對(duì)星狀細(xì)胞進(jìn)行干擾后，細(xì)胞的MyD88表達(dá)水平均降低，同時(shí)MyD88 siRNA、姜黃素單獨(dú)應(yīng)用時(shí)均不如MyD88+姜黃素的抑制作用強(qiáng)；而在對(duì)星狀細(xì)胞凋亡的影響作用上，姜黃素組、MyD88+姜黃素組的細(xì)胞明顯凋亡（P<0.05），而MyD88組未出現(xiàn)明顯凋亡（P>0.05），姜黃素組、MyD88+姜黃素組比較，MyD88+姜黃素組的凋亡率更高（P<0.05）。

總之，在肝星狀細(xì)胞降低MyD88的表達(dá)有助于提高姜黃素對(duì)其凋亡的促進(jìn)作用。