王聰聰，余慧，王彩霞，劉金平，綦戰(zhàn)文，高雪峰，趙春芳※

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130021；2.吉林省延邊韓工坊健康制品有限公司，吉林 延吉 133000；3.吉林省天億福健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司，吉林 長春 130000）

痛風(fēng)是尿酸鹽晶體在組織器官內(nèi)沉積所導(dǎo)致的關(guān)節(jié)病，與機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝紊亂或體內(nèi)尿酸排泄降低直接相關(guān)。臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)變形、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎[1-2]。其發(fā)病受遺傳、地理環(huán)境和飲食習(xí)慣等多種因素影響，各年齡段均有發(fā)病可能，但多發(fā)于中年男性[3]。目前，臨床常用化藥及中藥復(fù)方2 種方法治療痛風(fēng)。相比于毒副作用較大的化藥治療[4]，中藥治療因其多成分、多靶點且毒副作用較小，逐漸被廣泛應(yīng)用于痛風(fēng)的臨床治療[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論和生物網(wǎng)絡(luò)平衡理論，從“多成分-多靶點-復(fù)雜疾病”的整體模式出發(fā)，在分子水平上闡述藥物療效及作用機(jī)制[6]。其整體性和系統(tǒng)性的特點與中藥多成分及多靶點復(fù)雜的體系相契合[7-8]。

紅參祛痹飲液是根據(jù)中醫(yī)經(jīng)驗方，由紅參、葛根、荷葉等11 味藥食同源中藥材及苦蕎、玉米須、海洋魚低聚肽粉制備而成的產(chǎn)品。其中紅參補(bǔ)氣固脫；蒲公英、馬齒莧、淡竹葉和苦蕎清熱解毒；茯苓滲濕健脾；桑葉疏散風(fēng)熱；百合清心安神；梔子清熱利濕；葛根通經(jīng)活絡(luò)；菊苣和玉米須利尿消腫；荷葉升發(fā)清陽；海洋魚低聚肽促進(jìn)鈣的吸收，使鈣質(zhì)與骨細(xì)胞緊密結(jié)合，增加骨強(qiáng)度，可預(yù)防關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥等慢性骨科病[9-10]。近年來，在抗痛風(fēng)的研究報道中，紅參祛痹飲液中除了海洋魚低聚肽粉外，紅參[11]、蒲公英[12]、茯苓[13]、馬齒莧[14]、淡竹葉[15]、桑葉[16]、百合[17-18]、梔子[19-20]、葛根[21-22]、菊苣[23-24]、荷葉[25]、玉米須[26-27]和苦蕎[28]均具有一定的抗痛風(fēng)活性，但尚未發(fā)現(xiàn)作用靶點及復(fù)方作用機(jī)制的相關(guān)研究報道?；谝陨涎芯?，本文構(gòu)建了紅參祛痹飲液“化學(xué)成分-痛風(fēng)-靶點網(wǎng)絡(luò)”的網(wǎng)絡(luò)，以預(yù)測該飲液抗痛風(fēng)的關(guān)鍵靶點及信號通路，為闡明該保健食品預(yù)防和治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制提供思路和依據(jù)。

1 方法

1.1 紅參祛痹飲液有效成分及靶點的預(yù)測

利用TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫對紅參祛痹飲液所含有效成分進(jìn)行預(yù)測和篩選，篩選條件是口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 及類藥性（drug likeness，DL）≥ 0.18，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對有效成分進(jìn)行補(bǔ)充。將所得有效成分上傳至PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，對其命名規(guī)范化，并除去結(jié)構(gòu)相同但不規(guī)范的重復(fù)命名的成分?jǐn)?shù)據(jù)。

通過 Swiss Target Prediction（http://swisstargetprediction.ch/）、SymMap（https://www.symmap.org/）以及ETCM（http://www.tcmip.cn/ETCM/）等數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻(xiàn)查閱，對有效成分的靶點進(jìn)行預(yù)測，去除重復(fù)值并淘汰打分較低的靶點。

通過Cytoscape3.7.2[6]軟件構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，對紅參祛痹飲液的有效成分及對應(yīng)靶點進(jìn)行可視化分析。

1.2 痛風(fēng)靶點的預(yù)測

利用DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）等數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到痛風(fēng)靶點，結(jié)合文獻(xiàn)淘汰假陽性數(shù)據(jù)。

1.3 核心靶點的獲取

將紅參祛痹飲液有效成分靶點與痛風(fēng)靶點相映射，繪制韋恩圖。

1.4 “藥物-有效成分-痛風(fēng)-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape3.7.2[6]軟件構(gòu)建“藥物-有效成分-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)，對紅參祛痹飲液的有效成分及對應(yīng)靶點進(jìn)行可視化分析，同時經(jīng)過拓?fù)鋵傩苑治鲞M(jìn)行篩選得到了關(guān)鍵靶點。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將所得到的核心靶點上傳至String（http://stringdb.org/cgi/input.pl）數(shù)據(jù)庫，并設(shè)置相關(guān)參數(shù)，隱藏了離散節(jié)點（highest confidence=0.9），即為蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO生物過程富集分析及KEGG信號通路分析

首先，將所得核心靶點上傳至DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行 GO 和 KEGG 分析，下載數(shù)據(jù)文件，結(jié)合文獻(xiàn)篩選出和痛風(fēng)相關(guān)通路；其次，將通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Omicshare（https://auth.lifemapsc.com/）網(wǎng)站，將通路進(jìn)行可視化分析，生成KEGG氣泡圖；最后，將核心靶點的基因symbol IDs 導(dǎo)入g：Profile（rhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/convert）數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化為ensemble IDs，然后上傳到Omicshare 網(wǎng)站進(jìn)行GO 的可視化處理，得到GO 分析直方圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅參祛痹飲液及痛風(fēng)靶點的預(yù)測結(jié)果

共獲取148 個紅參祛痹飲液的有效成分，主要包括人參皂苷類、甾烷類和黃酮類等；據(jù)文獻(xiàn)報道，多種有效成分與痛風(fēng)治療密切相關(guān)，其中紅參有效成分的靶點映射到痛風(fēng)的治療靶點數(shù)目較多，說明紅參作為傳統(tǒng)中藥，在紅參祛痹飲液抗痛風(fēng)作用中發(fā)揮核心作用。

共獲取989 個有效成分的靶點，可視化分析結(jié)果見圖1，中間藍(lán)色方塊為靶點，左上角紫色圓形為紅參成分，淺粉色圓形為桑葉成分，橘色圓形為梔子成分，青色圓形為百合成分，淺粉色圓形為葛根成分，綠色圓形為菊苣成分，淺青色圓形為淡竹葉成分，紅色圓形為荷葉成分，黃色圓形為蒲公英成分，粉色圓形為茯苓成分，深藍(lán)色為玉米須成分，灰色為共有成分，深紫色為中藥材名稱。該網(wǎng)絡(luò)包含1 137 節(jié)點，5 785 條邊，其中山柰酚度（degree）值最大為182，其次是木犀草素度值為171，推測山柰酚和木犀草素在紅參祛痹飲液抗痛風(fēng)中發(fā)揮重要藥理作用，說明紅參祛痹飲液中多種中藥材發(fā)揮著作用。

圖1 “藥物-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig. 1 “Drug-active ingredients-targets”network

2.2 痛風(fēng)靶點的預(yù)測結(jié)果

基于DisGeNET 和Genecards 數(shù)據(jù)庫我們收集到了184 個和1 031 個關(guān)于痛風(fēng)的相關(guān)靶點，經(jīng)過合并并刪除重復(fù)靶點，共篩選得到1 015 個痛風(fēng)靶點。痛風(fēng)靶點如圖2 所示，紅色菱形為183 個核心靶點，視為篩選得到靶點，藍(lán)色方塊為832 個痛風(fēng)相關(guān)預(yù)靶點。

2.3 核心靶點篩選結(jié)果

將藥物有效成分靶點與疾病靶點取交集，得到183個藥物-疾病交集靶點，并以此作為后續(xù)研究的核心靶點，韋恩圖，見圖3。

圖3 活性成分靶點和痛風(fēng)相關(guān)靶點的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of active component targets and gout-related targets

2.4 “藥物-組分-有效成分-痛風(fēng)-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥物-組分-有效成分-痛風(fēng)-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)，見圖4，藍(lán)色方塊為核心靶點，深綠色最左側(cè)為痛風(fēng)，紫色菱形為中藥材，淺青色圓形為百合成分，淺綠色圓形為菊苣成分，深藍(lán)色圓形為玉米須成分，綠色圓形為蒲公英成分，黃色圓形為梔子成分，橘色圓形為荷葉成分，淺藍(lán)色圓形為淡竹葉成分，淺粉色圓形為桑葉成分，紅色圓形為茯苓成分，粉色圓形為葛根成分，紫色圓形為紅參成分，最淺藍(lán)色圓形為中藥共有成分。網(wǎng)絡(luò)包含327 個節(jié)點，1 761 條邊。其中紅參祛痹飲液所含組分的共有有效成分有17 種，分別為槲皮素、甘露醇、木犀草素、山柰酚、異鼠李素、異槲皮素、異甜菜素、芒柄花黃素、環(huán)阿屯醇、綠原酸、-谷甾醇、-胡蘿卜素、花生四烯酸、角鯊烯、豆甾醇、谷甾醇和蘆丁，提示這17 種共有有效成分對痛風(fēng)作用較強(qiáng)，可能是紅參祛痹飲液治療痛風(fēng)的關(guān)鍵成分。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果及拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果

2.5.1 PPI網(wǎng)絡(luò) PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖 5。該網(wǎng)絡(luò)包含 133 個節(jié)點，556 條邊，平均節(jié)點度值為8.36，節(jié)點代表靶點，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點內(nèi)部的螺旋狀結(jié)構(gòu)表示靶點的三維立體結(jié)構(gòu)，無填充的空白節(jié)點則表示未查詢到相應(yīng)靶點的3D結(jié)構(gòu)。節(jié)點之間的連線代表不同靶點之間的相互作用，線條顏色對應(yīng)不同蛋白互作類型，其中紫色（試驗驗證）和淺藍(lán)色（數(shù)據(jù)庫查詢）線條為目前已被證實的蛋白互作關(guān)系，而紅色（基因富集）、綠色（上下游基因）、深藍(lán)色（基因共表達(dá)）線條則表示可能存在某種潛在作用關(guān)系；同源蛋白質(zhì)或尚未驗證的關(guān)系等均由其他顏色表示。此外，從PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出，兩個靶點之間有多條連線，說明靶點間存在多種復(fù)雜的互作關(guān)系。

圖4 “藥物-組分-有效成分-痛風(fēng)-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)Fig.4 “Drugs-components-active ingredients-gout-core targets”network

圖5 核心靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Core target PPI network

2.5.2 拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果 PPI 網(wǎng)絡(luò)二次構(gòu)建結(jié)果，見圖6。拓?fù)鋵W(xué)結(jié)果顯示，STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF、PTPN11、JUN、RELA、VEGFA、MAPK14、MAPK8、FYN、JAK1、APP、JAK2、STAT1、EGF 和 LYN 等靶點度（degree）值大于25，具有度值高、介數(shù)中心性（betweenness centrality）大、高連通性等特點，在網(wǎng)絡(luò)中起著重要的作用，故以上述18 個靶點作為紅參祛痹飲液治療痛風(fēng)的候選關(guān)鍵靶點。將上述18 個靶點名稱、度值和介數(shù)進(jìn)行匯總，見表1。

圖6 Cytoscape3.7.2 構(gòu)建的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig. 6 PPI network constructed by Cytoscape 3.7.2

表1 18 個候選關(guān)鍵靶點Table 1 18 candidate key targets

2.5.3 Hub基因及關(guān)鍵基因的篩選結(jié)果 在PPI 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析基礎(chǔ)上，利用Cytohubba 插件篩選得到10個 Hub 基因，Degree ≥ 28，構(gòu)建 PPI 核心靶點網(wǎng)絡(luò)見圖7。節(jié)點平均度值為33.5，其中節(jié)點顏色深淺與度值呈正相關(guān)，即越接近紅色表示度值越大，越趨近于黃色，度值越小。明顯看出，STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF和PTPN11 顏色較深，且包含于上述18 個候選關(guān)鍵靶點，提示它們在網(wǎng)絡(luò)中的重要性較高，故選取STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF 和 PTPN11 作為關(guān)鍵靶點。除了這6 個關(guān)鍵基因外，找到與關(guān)鍵基因密切相關(guān)的鄰居基因，作為次關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步分析發(fā)揮作用。通過Cytoscape 3.7.2 軟件找出關(guān)鍵基因的鄰居基因，見表2。

表2 6 個關(guān)鍵靶點及其鄰居基因Table 2 Six key targets and their neighbor genes

2.6 GO 分析及 KEGG 分析結(jié)果

2.6.1 GO 生物過程富集分析結(jié)果 共得到53 個具有代表性的富集結(jié)果，其中生物過程（biological process，BP）條目27 個，分子功能（molecular function，MF）條目 11 個，細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目 15 個。直方圖，見圖8。柱狀圖越高，表示富集程度越顯著。結(jié)果顯示，GO-BP 富集程度最高，核心靶點主要富集于細(xì)胞過程（cellular process）、生物調(diào)節(jié)（biological regulation）和應(yīng)激反應(yīng)（response to stimulus）等生物過程，提示紅參祛痹飲液可能主要通過上述生物過程發(fā)揮治療痛風(fēng)的功效。

圖8 紅參祛痹飲液GO 富集分析Fig. 8 GO enrichment analysis of red ginseng qubi decoction

2.6.2 KEGG 信號通路分析結(jié)果 KEGG 高級氣泡圖，見圖9。點的大小與基因數(shù)目有關(guān)，氣泡顏色代表P 值的大小，橫坐標(biāo)代表富集分?jǐn)?shù)，縱坐標(biāo)標(biāo)注了12條信號通路名稱。其中Ras 信號通路、Focal adhesion信號通路和Toll-like 信號通路對應(yīng)氣泡較大，表示參與KEGG 通路的靶點較多，推測這幾條通路是紅參祛痹飲液治療痛風(fēng)的重要通路。對KEGG 通路及在通路中富集的靶點進(jìn)行了匯總，見表3。

圖9 紅參祛痹飲液KEGG 富集氣泡圖Fig.9 Bubble chart of KEGG enrichment about red ginseng qubi decoction

表3 紅參組的KEGG 通路及相應(yīng)靶點Table 3 The KEGG pathways and corresponding targets of red ginseng

續(xù)表3

2.6.3 “化合物-靶點-通路”圖 由圖10 可知，該網(wǎng)絡(luò)包含198 個節(jié)點，812 條邊，每種有效成分可作用于多個靶點，每個靶點連接多種成分，體現(xiàn)了紅參祛痹飲液治療痛風(fēng)具有多成分、多靶點的特點。環(huán)形外圈是有效成分，不同顏色代表屬于不同種類的中草藥，黃色菱形是13 種中草藥，淺灰色是篩選的通路，中間是通路涉及的痛風(fēng)靶點，不同大小的結(jié)構(gòu)代表節(jié)點與其他節(jié)點相連的多少，即度值高低，形狀越大度值越大，說明相應(yīng)的中草藥、成分、通路、靶點越重要。比如中草藥中的桑葉、梔子、紅參；成分中的人參皂苷Rh2、人參皂苷Rh4、山柰酚和木犀草素等；通路中的Ras、Toll-like receptor 和 PI3K-Akt signaling pathway 等；靶點中的TNF、VEGFA、PIK3CG、JUN和BCL2 等。此外，網(wǎng)絡(luò)中多條通路之間通過共有靶點連接，而非獨立分開，說明各通路之間協(xié)同發(fā)揮作用，從而達(dá)到治療痛風(fēng)的目的。

圖10 “紅參祛痹飲液-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig. 10 “Red ginseng qubi decoction-targets-pathways”network

3 結(jié)論與討論

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，共獲取148 種紅參祛痹飲液有效成分，989 個有效成分靶點，1 015 個痛風(fēng)靶點及183 個核心靶點；通過“藥物-組分-有效成分-痛風(fēng)-核心靶點”網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果，篩選得到6個紅參祛痹飲液抗痛風(fēng)的關(guān)鍵靶點（STAT3、MAPK1、SRC、IL6、TNF 和 PTPN11）；根據(jù)核心靶點的 GO 和KEGG 分析結(jié)果，篩選得到4 條可能的信號通路（Ras、Toll 樣受體、PI3K-AKT 和 TNF 信號通路）。初步預(yù)測了紅參祛痹飲液抗痛風(fēng)的作用機(jī)制。

王亞杰[29]研究發(fā)現(xiàn)山柰酚和木犀草素在一定濃度時對黃嘌呤氧化酶的抑制具有協(xié)同效應(yīng)。黃嘌呤氧化酶是體內(nèi)產(chǎn)生尿酸過程中的一個關(guān)鍵性酶，是產(chǎn)生痛風(fēng)的重要因素之一。木犀草素通過下調(diào)Toll 樣受體（Toll-likereceptors，TLR）/核因子 B（nuclearfactorkappa-B，NF- B）通路可減輕急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥的作用[30]。

朱月莉[31]研究發(fā)現(xiàn)Toll 樣受體是一種治療痛風(fēng)的潛在通路，其中的白細(xì)胞介素和腫瘤壞死因子是影響痛風(fēng)的關(guān)鍵基因；此外，痛風(fēng)會誘發(fā)神經(jīng)營養(yǎng)不良，在預(yù)測到的通路中，F(xiàn)ocal adhesion signaling pathway可能會對此產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[32]。與痛風(fēng)相關(guān)的高尿酸血癥可能會加速腫瘤進(jìn)展，增加癌癥風(fēng)險，在預(yù)測所得通路中，Ras signaling pathway 等信號通路與腫瘤的增長密切相關(guān)，通過調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)通路對通風(fēng)并發(fā)癥的增長起到抑制作用[33]。IL-10 信號通路主要作用于抑制痛風(fēng)炎性因子合成過程，阻斷促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的釋放，從而達(dá)到治療痛風(fēng)的作用[34]。研究顯示，痛風(fēng)結(jié)晶尿酸單鈉（MSU）對PI3K-AKT 有一定激活作用，說明PI3K-AKT 可調(diào)節(jié)痛風(fēng)的相關(guān)靶點[35]、MSU 晶體也可激活MAPK 途徑，對痛風(fēng)有一定治療作用[36]；沉積在滑膜和軟骨中的MSU 晶體能激活免疫細(xì)胞，如單核細(xì)胞、多形核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，以誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子釋放，這些因子包括白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1（IL-1 ）和腫瘤壞死因子（TNF），它們會導(dǎo)致軟骨和骨破壞，增加痛風(fēng)炎癥風(fēng)險，但通過藥物進(jìn)行靶向性調(diào)節(jié)已達(dá)到預(yù)防和治療的效果[37]。

與之前的紅參祛痹飲液研究相比，此次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對其進(jìn)行了成分、靶點和信號通路的預(yù)測，是紅參祛痹飲液抗痛風(fēng)的首次網(wǎng)絡(luò)預(yù)測分析，這將為后續(xù)研究提供思路和理論依據(jù)。