尚金燕，李桂榮，邵明輝，鄒小麗，李慶亮

（山東藥品食品職業(yè)學(xué)院·山東威?！?64210）

腎葉打碗花Calystegia soldanella(Linn.)R.Br.又稱為扶子苗、孝扇草、濱旋花、腎葉天劍。分布在山東、遼寧、河北、浙江、江蘇、臺灣等沿海地區(qū)[1]，是一種多年生的匍匐性草本植物，生長在海濱沙地上，或者海岸的巖石縫中。

腎葉打碗花作為藥用已有悠久的歷史，《本草綱目》記載該植物，花：甘；根：辛、溫、無毒；全草：甘滑微苦、能利雄黃；“花能去面皮干黑色，媚好益氣；根可去腹中寒熱邪氣，利小便”[2]。

已有的研究表明，腎葉打碗花中總黃酮含量較高[3]，而黃酮類化合物與抗氧化活性密切相關(guān)[4]。當(dāng)然，是否還有其他具有抗氧化活性的天然產(chǎn)物，還需要進(jìn)行下一步的研究。為了充分開發(fā)利用該植物資源，本研究以乙醇作為有機溶劑，研究了其乙醇提取物的抗氧化活性和抑制酪氨酸酶的活性。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

本研究所用腎葉打碗花，采自山東威海榮成成山林場，用烘箱50℃烘干，用粉碎機將全草粉碎，過60目篩得粉末。

1.2 試劑

DPPH、L-酪氨酸、酪氨酸酶，Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鄰苯三酚、水楊酸、HCl、H2O2、乙醇、均為分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

紫外分光光度計T6型 （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；酶標(biāo)儀ER-504（山東博科科學(xué)儀器有限公司）；十萬分之一電子天平ME55（梅特勒）；IKA RV10 Basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-301（上?？婆d儀器有限公司）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 有效成分提取

準(zhǔn)確稱量5.010g腎葉打碗花粉末，加入50%的乙醇100mL，室溫浸泡24h，然后80℃回流提取浸泡液3h，冷卻過濾，收取濾液；殘渣中再次加入500mL體積分?jǐn)?shù)50%的乙醇，在80℃下繼續(xù)回流提取3h，冷卻過濾，收取濾液，將兩次濾液合并，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，50℃溫度下濃縮，得到腎葉打碗花膏狀提取物。

2.2 抗氧化活性實驗

2.2.1 DPPH·清除能力實驗

參照文獻(xiàn)方法[5～7]測定腎葉打碗花提取物DPPH·清除能力。準(zhǔn)確稱取避光冷藏保存的DPPH 30.90 mg，加入無水乙醇溶解于250 mL棕色容量瓶中，避光保存，備用。

用乙醇稀釋腎葉打碗花提取物，分別稀釋成質(zhì)量濃度為 0.5、1.0、3.0、5.0、10.0mg.mL-1， 分別取不同質(zhì)量濃度的提取物1mL、0.2mmol.L-1DPPH乙醇溶液1.5mL于試管中，混合搖勻后，立刻放置于暗室中，反應(yīng)1h。使用無水乙醇調(diào)零，測定波長517nm處的吸光值為Abs樣本。重復(fù)操作，將樣本用無水乙醇替換，測定吸光值為Abs空白。測定不同濃度提取物對DPPH·的清除率，繪制清除率對提取液濃度曲線，根據(jù)線性方程計算清除率為50%時的濃度值，即得到IC50。

DPPH·清除率計算如下:

DPPH·清除率(%)=(1-Abs樣本/Abs空白)×100

圖1 腎葉打碗花提取物對DPPH·的清除效果

由圖1可以看出，隨著提取液濃度的增加，DPPH·清除率逐漸升高，在最大樣品濃度下，清除率達(dá)到60.24%，腎葉打碗花乙醇提取物清除DPPH·的IC50約為2.885mg.mL-1。結(jié)果表明，腎葉打碗花乙醇提取物對DPPH·有一定的清除效果，乙醇提取物具有一定的抗氧化性。

2.1.2 ·OH清除能力實驗[8]

H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生·OH，在反應(yīng)體系中加入水楊酸后，·OH與水楊酸反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，在波長510nm處該物質(zhì)有最大吸收。如果向反應(yīng)體系中加入具有清除羥自由基功能的被測物，就會減少生成的自由基，從而使有色物質(zhì)的生成量減少。體系中先加入FeSO4（9mmol.L-1） 1mL、水楊酸-乙醇溶液（9mmol.L-1）1mL，不同提取濃度樣品溶液1mL。 最后加H2O2（8.8mmol.L-1）1 mL 啟動反應(yīng)，37℃下反應(yīng) 0.5h。以蒸餾水作為對照，測定510nm處各樣品溶液的吸光值。考慮樣品本身存在的吸光值，以FeSO4（9 mmol.L-1）1mL、水楊酸-乙醇溶液（9mmol.L-1）1mL、不同濃度樣品溶液1mL和1mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值。按以下公式計算樣品·OH清除率。

·OH 清除率（%）=[A0-（Ax-Ax0）]/A0×100

其中：A0—空白對照溶液的吸光值；Ax—樣品溶液的吸光值；Ax0—不加H2O2樣品溶液的吸光值。

圖2 腎葉打碗花提取物對·OH的清除效果

由圖2可以看出，腎葉打碗花提取物對·OH的清除作用隨著濃度的增加而增強，表明腎葉打碗花乙醇提取物具有較好的清除·OH的作用。

2.1.3 O2-·清除能力實驗

清除O2-·的實驗參照文獻(xiàn)進(jìn)行[9]，實驗利用鄰苯三酚來測定。取4.5 mL 50 mmol.L-1Tris-HCl（pH8.2）緩沖液，放置于25℃的水浴中，保溫作用20min，加入1mL樣品溶液、0.4mL 25mmol.L-1鄰苯三酚溶液，混合均勻，然后放置于25℃水浴中，反應(yīng)5min，最后加入1mL 8mmoll.L-1HCl終止反應(yīng)，測定299nm處吸光度（Ax）?？瞻讓φ战M（A0）以同樣體積的蒸餾水來替換樣品。每個樣品重復(fù)3次，測量后取平均值，根據(jù)以下公式來計算O2-·的清除率。

O2-·清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100

圖3 腎葉打碗花提取物對O2-·的清除效果

如圖3所示，在鄰苯三酚自氧化體系中，隨著提取液濃度的增加，抑制自氧化的能力也增強，很好的起到了清除超氧陰離子的作用。

2.2 抑制酪氨酸酶活性實驗[10]

精確稱取腎葉打碗花乙醇提取物，以PBS緩沖溶液作為溶劑， 配制成濃度依次為 2、6、10、12、20mg.mL-1的樣品溶液。在96孔板中分別添加以下物質(zhì)：不同稀釋濃度樣品溶液50μL、PBS緩沖液80μL、酪氨酸酶溶液 50μL，分別設(shè)置 3個復(fù)孔，37℃下作用10min，然后向每個加樣孔中加入20μL底物，孵育30min，最后用酶標(biāo)儀來測定475nm處的吸光值，每個樣品重復(fù)測量3次。記錄吸光值。酪氨酸酶抑制率的計算公式如下：

抑制率 =[(A-B)-(C-D)]/(A-B)×100%，

公式中，A是空白對照組（PBS 130μL+酶 50μL+底物 20μL）；B 是空白背景組 （PBS 180μL+底物20μL）；C 是不同濃度樣品組（PBS 80μL+酶 50μL+樣品溶液 50μL+底物 20μL）；D 是實驗背景組（PBS 130μL+供試品溶液 50μL+底物 20μL）。

表1 不同濃度提取物對酪氨酸酶的抑制率

如表1所示，腎葉打碗花乙醇提取物對酪氨酸酶催化活性具有明顯的抑制作用，而且隨著濃度的升高而增強，IC50值為2.95 mg/mL。

3 結(jié)論

為了分析腎葉打碗花的抗氧化活性，本研究用乙醇作為溶劑，提取了腎葉打碗花提取物，對其清除DPPH·、·OH、O2-·的能力和抑制酪氨酸酶活性進(jìn)行了測定。實驗結(jié)果表明，腎葉打碗花乙醇提取物對各種自由基均具有一定的清除能力，并能抑制酪氨酸酶的活性。

腎葉打碗花可以入藥，已有研究者提取了該藥材的有效成分進(jìn)行了分析探討。Motoo Tori從孝扇草的莖中分離出反式-4-羥基桂皮酸酯、反式-4-羥基桂皮酸和反式-3,4-二羥基桂皮酸[11]。黃真等發(fā)現(xiàn)該藥材的水提液具有較強的抗炎鎮(zhèn)痛作用[12]。但目前關(guān)于腎葉打碗花抗氧化活性方面尚未有研究。本研究以乙醇作為有機溶劑，提取了其有效成分，研究其抗氧化活性，后期將進(jìn)一步研究該植物的抗氧化活性，研究其他不同溶劑提取物的抗氧化作用，并通過實驗研究，跟蹤分離提取活性有效成分，為開發(fā)該藥材抗氧化藥物和抗氧化制劑奠定基礎(chǔ)。