王曉琳 孫偉波 李朝輝 黃潔雪 鄔劼 吉沐祥

摘要：以桃褐腐病病菌（Monilinia fructicola）為供試菌，采用菌絲生長速率法，測定腈苯唑、補(bǔ)骨脂種子提取物、丙硫菌唑、咯菌腈、氟啶胺和吡唑醚菌酯對桃褐腐病病菌的毒力。結(jié)果表明，5種化學(xué)殺菌劑對桃褐腐病病菌的抑制中濃度最低的是丙硫菌唑，其EC50僅為0.003 5 μg/mL，其次是腈苯唑，其EC50為0.003 8 μg/mL，抑制中濃度最高的為吡唑醚菌酯，其EC50為0.576 7 μg/mL。在離體條件下測定補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比篩選試驗，結(jié)果表明，當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑的質(zhì)量比為10 ∶1時，EC50僅為0.010 4 μg/mL，SR值為3.744 5;比例為1 ∶1和 1 ∶5 時SR次之，分別為2.875 2和2.056 4。綜合離體試驗結(jié)果和經(jīng)濟(jì)因素，確定補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑防治桃褐腐病病菌的最佳比例為1 ∶1。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)骨脂種子提取物;丙硫菌唑;桃褐腐病病菌;復(fù)配;增效作用

中圖分類號： S436.621.1+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0114-05

收稿日期：2019-11-21

基金項目：江蘇省重點研發(fā)計劃（編號：BE2018389）;國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD0201400-2）。

作者簡介：王曉琳（1986—），女，遼寧營口人，碩士，助理研究員，主要從事應(yīng)時鮮果病蟲草害防治研究。E-mail：morethan365@126.com。

通信作者：吉沐祥，研究員，主要從事果樹植保與農(nóng)藥開發(fā)研究。E-mail：jilvdun2800@163.com。

桃人工栽培歷史悠久，距今已有4 000多年歷史，是我國主要水果之一。桃褐腐病是由子囊菌鏈核盤菌（Monilinia spp.）侵染造成的，桃褐腐病通常發(fā)生在開花旺盛期和采收前，危害桃樹葉片、花朵、枝條和果實，引起腐爛枯死，環(huán)境條件適宜時會在采后桃貯藏、運(yùn)輸和銷售中發(fā)生，導(dǎo)致桃果實產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響[1-2]。目前，防治桃褐腐病的主要手段是化學(xué)防治，主要殺菌劑有三唑類、苯丙咪唑類、二甲酰亞胺類和甲氧基丙烯酸酯類等。何獻(xiàn)聲通過試驗19種殺菌劑對桃褐腐病離體抑菌活性發(fā)現(xiàn)，啶菌唑和腈苯唑?qū)μ液指‰x體抑菌活性較為突出，10 mg/L質(zhì)量濃度下，啶菌唑和腈苯唑?qū)μ液指〔【z生長抑菌率達(dá)100%[3]。紀(jì)兆林等通過采用菌絲生長抑制法測定8類15種殺菌劑對桃褐腐病病菌的毒力效果發(fā)現(xiàn)，毒力作用最強(qiáng)的是咪鮮胺，其次是己唑醇[4]。周瑩等通過研究幾種殺菌劑對桃褐腐病的毒力測定及田間控制作用發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈和復(fù)配殺菌劑克菌·戊唑醇對大連地區(qū)桃褐腐病病菌具有較強(qiáng)毒力[5]。由于長期使用單一作用位點的殺菌劑，會使病原菌對殺菌劑產(chǎn)生抗藥性。陳淑寧通過研究桃褐腐病病菌對甾醇脫甲基抑制劑類（DMI）殺菌劑的抗性發(fā)現(xiàn)，采自云南省的16株桃褐腐菌株中，15株對多菌靈產(chǎn)生抗性，并且和乙霉威產(chǎn)生負(fù)交互抗性[6]。

相關(guān)研究表明，利用生物農(nóng)藥或植物源殺菌劑能夠安全有效地控制植物病害。侯旭等發(fā)現(xiàn)，從桃樹根部組織中分離到的內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4菌株對桃褐腐病病原菌的生長有明顯的抑制作用[7]。紀(jì)兆林等通過研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌菌株W10菌液及其產(chǎn)生的抗菌蛋白對貯藏期桃褐腐病有較好的抑制作用，高濃度效果更好，W10菌液和抗菌蛋白浸果處理能顯著降低貯藏期的桃自然腐爛率，與多菌靈效果相當(dāng)[8]。袁雪等從高產(chǎn)桃園土壤中分離、篩選得到特基拉芽孢桿菌菌株B-23，以1×109 CFU/mL 菌懸液處理桃果實、葉片和枝條，對桃褐腐病抑制率分別為74.5%、83.3%和60.0%[9]。補(bǔ)骨脂種子提取物是沈陽同祥生物農(nóng)藥有限公司2019年登記的植物源農(nóng)藥，其有效成分可通過破壞病原菌的細(xì)胞膜、線粒體膜、核膜等膜系統(tǒng)和干擾細(xì)胞代謝過程而達(dá)到殺菌的目的。丙硫菌唑是拜耳公司開發(fā)的新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑[10]，屬甾醇脫甲基化（麥角甾醇的生物合成）抑制劑。具有選擇性、保護(hù)性、治療性和持效性等特點，2019年在我國的2家公司：安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司和山東海利爾化工有限公司取得登記。本研究選用植物源農(nóng)藥補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑復(fù)配，明確2種藥劑的最佳配比，旨在為桃褐腐病的防治提供理論指導(dǎo)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

1.1.1?供試菌株

桃褐腐病菌（M. fructicola）采自江蘇省溧水白馬基地桃園，由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院分離、鑒定并保存?zhèn)溆?。菌株保存于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）斜面上（4 ℃）。實驗室內(nèi)在PDA培養(yǎng)基平板上轉(zhuǎn)接1次后，于25 ℃預(yù)培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm菌絲塊用于測定。

1.1.2?試驗時間與地點

本試驗于2019年4—6月在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實驗室進(jìn)行。

1.1.3?供試藥劑?供試藥劑詳見表1。

1.2?試驗方法

1.2.1?藥液的配制及濃度設(shè)計

將試驗藥劑用蒸餾水溶解，配制成1 000 μg/mL的母液。

桃褐腐病病菌不同藥劑單劑的濃度設(shè)計見表2。

補(bǔ)骨脂種子提取物、丙硫菌唑與不同配方的濃度設(shè)計見表3。

單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計均為6個2倍稀釋的梯度濃度含藥PDA培養(yǎng)基，所有試驗藥劑系列濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2?殺菌劑對桃褐腐病病菌室內(nèi)毒力測定

25 ℃ 條件下培養(yǎng)3 d后利用十字交叉法測量各處理菌落直徑，以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基為對照，每處理重復(fù)4次。計算出藥劑的抑制百分率，按毒力回歸方程Y=a+bx計算藥劑抑制菌絲生長的有效中濃度（EC50），作為毒力參數(shù)。計算公式為D=D1-D2。式中：D為菌落增長直徑;D1為菌落直徑;D2為菌餅直徑）。I=（D0-Dt）/D0*100%。式中：I為菌絲生長抑制率;D0為空白對照菌落增長直徑;Dt為藥劑處理菌落增長直徑。

1.2.3?殺菌劑對桃褐腐病病菌的最佳配比離體試驗篩選

采用機(jī)率值分析法計算每個殺菌劑對靶標(biāo)菌菌絲生長的有效抑制中濃度，并通過下面公式計算混合藥劑的增效系數(shù)（SR）。

EC50（Exp）=a+baEC50（A）+bEC50（B）;

SR=EC50（Exp）EC50（Obs）。

式中：字母a代表藥劑A在混合藥劑中所占的比例;字母b代表藥劑B在混合藥劑中所占的比例;EC50 （Obs）為實際測定的混合藥劑對病原菌的抑制中濃度;EC50（Exp）為混合藥劑對病原菌的理論抑制中濃度。通過上面2個公式計算得每個設(shè)定比例的配方的SR值，SR>1.5說明2種藥劑復(fù)配具有增效作用，0.5≤SR≤1.5說明2種藥劑之間復(fù)配具有相加作用，SR<0.5表明2種藥劑為拮抗作用[11]。

2?結(jié)果與分析

2.1?室內(nèi)抑菌活性測定

2.1.1?不同種類殺菌劑對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑制作用

從表4可以看出，當(dāng)腈苯唑為 0.006 25～0.200 00 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為85.53%～100%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物為0.375～12.000 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為42.76%～67.43%;當(dāng)丙硫菌唑為0.006 25～0.200 00 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為88.49%～100%;當(dāng)咯菌腈為 0.062 5～2.000 0 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為67.76%～100%;當(dāng)氟啶胺為 0.031 25～1.000 00 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為65.78%～100%;當(dāng)吡唑醚菌酯為0.375 ～12.000 μg/mL 時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為57.04%～100%。

不同殺菌劑對桃褐腐病病菌的毒力測定結(jié)果見表5，對桃褐腐病病菌抑制中濃度最低的是丙硫菌唑，其次是腈苯唑。6種單劑的活性（EC50）分別為丙硫菌唑（0.003 5 μg/mL）>腈苯唑（0.003 8 μg/mL）>氟啶胺（0.042 2 μg/mL）>咯菌腈（0.084 0 μg/mL）>吡唑醚菌酯（0.576 7 μg/mL）>補(bǔ)骨脂種子提取物（1.679 2 μg/mL）。

2.1.2?補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑?qū)μ液指〔【z生長的抑制作用

從表6可以看出，當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物為0.375～12.000 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為22.54%～8350%;當(dāng)丙硫菌唑為0.003 125～0.100 000 μg/mL時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為56.40%～100%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比10 ∶1的濃度為0.006 25～0.200 00 μg/mL 時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為42.12%～99.33%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比為5 ∶1的濃度為0003 125～0.100 000 μg/mL 時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為6.31%～85.77%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比1 ∶1的濃度為 0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為44.91%～99.02%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比1 ∶5的濃度為0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為64.24%～100%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比1 ∶10的濃度為0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 時，對桃褐腐病病菌菌絲生長的抑菌率為65.52%～100%。

將表4中篩選的補(bǔ)骨脂種子提取物和丙硫菌唑進(jìn)行復(fù)配，采用Wedley法確定其最佳配比（表7）。由毒力回歸曲線方程、抑制中濃度和SR值可以得出補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑的比例在10 ∶1時，SR值最大，為3.74，此時EC50為0.010 4 μg/mL。比例在1 ∶1、1 ∶5和1 ∶10時SR值比較大，分別為2875 2、2.056 4和1.979 7，所以根據(jù)試驗結(jié)果和從價格方面考慮，推薦補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑以1 ∶1復(fù)配。

3?討論

目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)已進(jìn)入新時代，從關(guān)注作物自身安全轉(zhuǎn)為保障整個農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加工系統(tǒng)的可持續(xù)性，尋找新的高效、低毒和環(huán)境相容性好的殺菌劑是當(dāng)前研究的趨勢，一些中草藥提取物具有殺菌作用，對人體和環(huán)境無危害，增加了對水果食用的安全性。植物源殺菌劑指的是從具有殺菌、抑菌活性的天然植物的某些部位提取有效成分，將其分離純化然后經(jīng)過加工得到的藥劑。關(guān)麗杰等通過液體培養(yǎng)方法研究補(bǔ)骨脂提取物對蘋果腐爛病病菌菌絲生長的抑制作用發(fā)現(xiàn)，當(dāng)補(bǔ)骨脂提取物濃度為 80 mg/L 時，對蘋果腐爛病病菌菌絲干質(zhì)量的抑制率達(dá)98.3%[12]。關(guān)麗杰等采用菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法，研究補(bǔ)骨脂提取物對黃瓜炭疽病病菌菌絲生長的抑制中濃度（EC50）為62.973 mg/L，孢子萌發(fā)的抑制中濃度為8.213 mg/L[13]。本試驗通過菌絲生長速率法測定補(bǔ)骨脂種子提取物抑制桃褐腐病病菌菌絲生長的EC50為1.679 2 μg/mL。相比于傳統(tǒng)的三唑類殺菌劑，丙硫菌唑在化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入硫酮結(jié)構(gòu)，殺菌譜更廣，內(nèi)吸性更好，持效期更長。據(jù)相關(guān)報道，丙硫菌唑?qū)π←湷嗝共14]、人參菌核病[15]、水稻惡苗病[16]、梨樹褐斑病、黑星病、白粉病[17] 等有很好的防治效果，在桃褐腐病上的防治應(yīng)用還未見報道。本研究6種殺菌劑對桃褐腐病病菌的毒力測定結(jié)果表明，抑制中濃度最低的是丙硫菌唑，5種化學(xué)農(nóng)藥單劑的活性（EC50）分別為丙硫菌唑（0.003 5 μg/mL）>腈苯唑（0.003 8 μg/mL）>氟啶胺（0.042 2 μg/mL）>咯菌腈（0.084 0 μg/mL）>吡唑醚菌酯（0.576 7 μg/mL）。

藥效增效復(fù)配可以完善植物源活性物質(zhì)與活性成分研究的技術(shù)體系，突破植物源農(nóng)藥產(chǎn)品劑型單一、多為單劑的現(xiàn)狀，推動及促進(jìn)我國植物源農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本研究通過試驗和綜合經(jīng)濟(jì)因素得出，補(bǔ)骨脂種子提取物和丙硫菌唑殺菌劑以 1 ∶1 的比例混合，在離體條件下對桃褐腐病病菌具有增效作用，為有效的防治桃褐腐病提供了依據(jù)，以便更好地為農(nóng)業(yè)服務(wù)，其在田間的實際防治效果還有待進(jìn)一步的試驗驗證。

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