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        重組菌絲霉素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及活性研究

        2020-10-20 05:58:30鄧贛奇陳柏東黃增穎宮莉張輝華劉燊
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年18期

        鄧贛奇 陳柏東 黃增穎 宮莉 張輝華 劉燊

        摘要:為獲得一種能分泌菌絲霉素的畢赤酵母菌并探討菌絲霉素的活性,將優(yōu)化的目的蛋白堿基序列與標(biāo)簽MBP基因序列融合,通過(guò)雙酶切將重組基因序列插入到畢赤酵母pGAPZaA表達(dá)載體上并進(jìn)行連接反應(yīng)。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞,挑取含Zeocin(25 mg/L)平板篩選出的單菌落進(jìn)行PCR鑒定,將陽(yáng)性克隆送往測(cè)序公司測(cè)序。對(duì)鑒定正確的含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進(jìn)行活化培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒,得到的重組質(zhì)粒進(jìn)一步線性化和純化,并電轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)細(xì)胞中篩選出陽(yáng)性克隆,誘導(dǎo)分泌蛋白,對(duì)其進(jìn)行Western blot檢測(cè)、純化、活性分析和質(zhì)譜鑒定,得到的重組蛋白為55 Ku左右,濃度為700 mg/L,純度達(dá)到80%以上。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明,蛋白序列的覆蓋率達(dá)到98%,純化后的蛋白也對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用,成功構(gòu)建出一株能夠分泌菌絲霉素的畢赤酵母菌,這為菌絲霉素的工業(yè)化生產(chǎn)和研發(fā)新型綠色的飼料添加劑奠定了基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:菌絲霉素;畢赤酵母;重組蛋白;飼料添加劑

        中圖分類號(hào):S182;S816.7?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

        文章編號(hào):1002-1302(2020)18-0086-06

        收稿日期:2019-11-03

        基金項(xiàng)目:佛山市生物活性肽工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(編號(hào):2017GA00022);廣東省教育廳高??蒲许?xiàng)目(編號(hào):2017GCZX006)。

        作者簡(jiǎn)介:鄧贛奇(1995—),男,江西贛州人,碩士研究生,從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail:dengganqi@foxmail.com。

        通信作者:劉?燊,博士,副教授,主要從事動(dòng)物生物技術(shù)與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail:shencn@aliyun.com。

        抗生素自被發(fā)現(xiàn)以來(lái),為人類社會(huì)做出了極大貢獻(xiàn),它不僅拯救了無(wú)數(shù)人的生命,更使畜牧生產(chǎn)得到了極大的提高。但隨著抗生素的大量使用和濫用,抗生素在畜禽體內(nèi)大量殘留,威脅著食品安全并影響生態(tài)環(huán)境,這使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性而出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”。在歐洲的一些國(guó)家如瑞典,在1986年禁止向飼料中添加抗生素[1],而為響應(yīng)國(guó)家綠色發(fā)展的理念,我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)局局長(zhǎng)馮忠武在2018年的中國(guó)飼料發(fā)展論壇上表示,藥物飼料添加劑將在2020年全部退出[2],“減抗”“替抗”因此成為了非常熱的研究方向,目前研究人員新研制出許多“減抗”“替抗”的產(chǎn)品,如微生態(tài)制劑、酶制劑、酸化劑、中草藥制劑、抗菌肽等??咕淖鳛榫G色、高效、低毒、廣譜的飼料添加劑,是現(xiàn)在比較熱門(mén)的研究對(duì)象之一。

        抗菌肽是生物體在抵抗病原菌時(shí)產(chǎn)生的一種防御性小肽,是組成免疫系統(tǒng)的重要組成成分,它對(duì)真菌、病毒、腫瘤等均有抑制作用,抗菌譜廣、分子量小、不易產(chǎn)生耐藥性、熱穩(wěn)定性和水溶性好,是目前替代抗生素較為理想的抗菌劑之一[3]。菌絲霉素是Mygind等從腐生子囊菌的分泌蛋白中分離得到,它是首次發(fā)現(xiàn)的真菌防御素,對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生危害[4]。Schneider等研究表明,菌絲霉素的作用機(jī)制主要是通過(guò)阻斷細(xì)胞壁的合成而起到殺菌的作用[5]。有研究表明,菌絲霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抑制能力,沒(méi)有溶血性作用,可以用來(lái)治療感染革蘭氏陽(yáng)性菌的疾病,可替代部分的抗生素類藥物[6-7]。傳統(tǒng)獲得菌絲霉素的方法是從天然微生物中分離提取,但這種方法分離純化工序復(fù)雜、成本高、產(chǎn)量低,限制了其廣泛的應(yīng)用。

        近年來(lái),得益于基因工程的大力發(fā)展,通過(guò)構(gòu)建高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)即可獲得更多的菌絲霉素。根據(jù)萬(wàn)津的研究,將Ple多聚體基因克隆到畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPICZaA,轉(zhuǎn)化后得到1株基因工程菌PPle,通過(guò)搖瓶誘導(dǎo),畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平達(dá)143 mg/L[8]。李洪金等探討重組NZ2114畢赤酵母工程菌的高效發(fā)酵工藝,并從培養(yǎng)基配方、接種條件、甲醇誘導(dǎo)、流加方式、菌體濕重等幾個(gè)方面入手,結(jié)果發(fā)現(xiàn),使用BSM培養(yǎng)基,接種量為15%,甲醇誘導(dǎo)48 h,濕重達(dá)到3×105 mg/L時(shí),菌絲霉素的表達(dá)量是最高的且活性達(dá)到最佳狀態(tài),此時(shí)的成本也控制在可接受范圍內(nèi)[9]。李延的重組菌絲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)表明,甘油基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基為最適發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵114 h時(shí),上清液的總蛋白濃度可達(dá)3 941 mg/L[10]。

        本試驗(yàn)通過(guò)重組菌絲霉素基因序列,將其克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZaA中,構(gòu)建出一種胞內(nèi)表達(dá)菌絲霉素的畢赤酵母菌,再通過(guò)適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵條件,分離純化獲得菌絲霉素,為其工業(yè)化生產(chǎn)以及重組菌絲霉素作為飼料添加劑的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

        1?材料與方法

        1.1?試驗(yàn)菌種與質(zhì)粒

        畢赤酵母GS115菌用于重組載體的表達(dá);pMAL-c5x質(zhì)粒(10 ng/μL)用于擴(kuò)增編碼融合標(biāo)簽MBP的基因序列;DH5α感受態(tài)細(xì)胞;pGAPZaA載體。

        1.2?試驗(yàn)試劑

        試驗(yàn)主要試劑有UltraPureTM DNase/RNase-Free Distilled Water(10977015,Invitrogen)、2×Hotstart Taq PCR ProMix、2×PfuMax HiFi PCR ProMix,均購(gòu)自廣州英贊生物科技有限公司;凝膠純化試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,均購(gòu)自天根生化科技有限公司;10×FD buffer、10×T4 ligase buffer、10×Cutsmart Buffer、Buffer A[50 mmol/L三甲醇氨基甲烷(pH值8.0)、50 mmol/L 氯化鈉、5%甘油]、洗脫緩沖液Buffer B[50 mmol/L三甲醇氨基甲烷(pH值8.0)、50 mmol/L氯化鈉、500 mmol/L咪唑、5%甘油];Low Salt LB(不含抗生素)培養(yǎng)液;抗生素Zeocin;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶(AvrⅡ、EcoRⅠ和XbaⅠ)、DNA marker、蛋白質(zhì)marker,均購(gòu)自大連TaKaRa公司;YPDS培養(yǎng)基(10.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖、1.0 mol/L山梨醇);LDST溶液[100 mmol/L LiAc,10 mmol/L dithiothreitol,0.6 mol/L sorbitol,10 mmol/L Tris-HCl(pH值75),現(xiàn)用現(xiàn)配不能保存];考馬斯亮藍(lán)G-250;其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.4.6?重組菌絲霉素在畢赤酵母中的表達(dá)檢測(cè)和濃度的測(cè)定?在30 ℃、250 r/min條件下分別培養(yǎng)0、6、12、24、48、72、96 h,用15 mL離心管取6 mL培養(yǎng)液,于8 000 r/min離心5 min,上清轉(zhuǎn)至另一個(gè) 15 mL 離心管,不同表達(dá)時(shí)間的培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀并復(fù)溶后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。考馬斯亮藍(lán)與芳香族氨基酸在酸性介質(zhì)中結(jié)合后,溶液變成藍(lán)色,溶液的最大吸收峰從465 nm轉(zhuǎn)成595 nm,因?yàn)轭伾淖兓潭扰c蛋白濃度呈正比,所以再檢測(cè)595 nm處溶液中蛋白質(zhì)濃度的吸光度,即可進(jìn)一步得其濃度,所得重組菌絲霉素蛋白的濃度為 700 mg/L,用50 mmol/L三甲醇氨基甲烷(pH值80)、50 mmol/L氯化鈉和5%甘油的緩沖液將其儲(chǔ)存。

        1.4.7?重組菌絲霉素蛋白的質(zhì)譜鑒定?將純化所得重組菌絲霉素蛋白液加入0.05 mol/L TCEP溶液,60 ℃反應(yīng)1 h,還原完后,加入 55 mmol/L MMTS溶液,并在室溫下避光45 min;然后將菌絲霉素蛋白液加入10 Ku超濾管中,12 000 g下離心20 min,后加入100 μL UA(8 mol/L urea,pH值8.5)溶液,12 000 g 離心20 min,并離心2次,將 100 μL 0.25 mol/L TEAB加入到超濾管中,12 000 g離心20 min,重復(fù)3次;繼續(xù)加入50 μL 0.5 mol/L TEAB溶液和2%胰酶(胰酶與蛋白質(zhì)量比為1 ∶50),在37 ℃下孵育12 h。次日補(bǔ)加1%胰酶(胰酶與蛋白質(zhì)量比為1 ∶100),并在37 ℃孵育4 h,離心收集濾液,低溫真空抽干。

        所得樣品用0.1%甲酸、2%乙腈混合液進(jìn)行溶解,在13 200 r/min,4 ℃條件下離心20 min,取上清,進(jìn)行質(zhì)譜鑒定;做完質(zhì)譜后,還需將質(zhì)譜原始文件經(jīng)過(guò)MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換,然后將所得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析。

        1.4.8?重組菌絲霉素蛋白體外抑菌活性的測(cè)定?將保存在-20 ℃的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌菌液劃板活化,直至長(zhǎng)出單菌落為止,挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中,孵化培養(yǎng)12 h,用3個(gè)錐形瓶分別配制100 mL LB固體培養(yǎng)基,在滅完菌冷卻至45 ℃時(shí),分別吸取100 μL菌液加入到培養(yǎng)基中并輕輕搖均勻倒板,待板干燥后擺放好牛津杯,將提純得到的重組菌絲霉素蛋白(700 mg/L)稀釋10倍、100倍,吸取200 μL分別加入牛津杯中,空白對(duì)照則加無(wú)菌水,并做3個(gè)重復(fù),然后放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h,用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的大小。

        2?結(jié)果與分析

        2.1?重組基因的驗(yàn)證

        在完成標(biāo)簽MBP基因序列的PCR擴(kuò)增編碼融合,合成重組有MBP標(biāo)簽的目的蛋白基因序列后,分別取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖電泳分析,結(jié)果(圖1、圖2)表明,擴(kuò)增大小與理論預(yù)測(cè)相符合。

        2.2?pGAPZaA-MBP表達(dá)載體的驗(yàn)證

        挑取12個(gè)“1.4.5”節(jié)中平板上的單菌落,分別溶到500 μL含25 μg/mL Zeocin的Low Salt LB培養(yǎng)液中,37 ℃、180 rpm/min振蕩培養(yǎng)4 h,每管取 0.5 μL 菌液作模板進(jìn)行PCR,后取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖電泳分析,用載體上游和下游引

        物擴(kuò)增的條帶理論大小為1 300 bp左右,結(jié)果表明,實(shí)際擴(kuò)增條帶為1 500 bp,符合合理的范圍內(nèi),而除第8、9號(hào)外其他均為陽(yáng)性克隆菌(圖3),為進(jìn)一步鑒定,挑取10、11號(hào)菌進(jìn)行測(cè)序,測(cè)得部分結(jié)果如圖4所示,其中小寫(xiě)部分為N端融合標(biāo)簽MBP蛋白的部分基因序列,標(biāo)記下劃線部分為目的蛋白的基因序列即菌絲霉素的基因序列,標(biāo)記方框部分為C端融合標(biāo)簽的基因序列,測(cè)序結(jié)果表明MBP基因克隆正確,成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGAPZaA-MBP。

        2.3?重組菌絲霉素蛋白的純化及在畢赤酵母中的表達(dá)檢測(cè)

        純化后的重組菌絲霉素蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,由圖5可見(jiàn),蛋白純化后純度在80%以上。將不同時(shí)間的培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀并復(fù)溶后進(jìn)行Western blot檢測(cè),由圖6可知,帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白獲得了可溶性表達(dá),并且在 48 h 培養(yǎng)后目的蛋白的表達(dá)量趨于飽和,因此表達(dá)培養(yǎng)時(shí)間為48 h較好。

        2.4?重組菌絲霉素蛋白的質(zhì)譜鑒定

        根據(jù)質(zhì)譜的鑒定分析可得重組菌絲霉素蛋白完整的氨基酸序列,如圖7所示,其中標(biāo)記方框部分表示未匹配上的序列,其余部分均為匹配上的序列,將鑒定分析出的序列用MASCOT(V21,Matrix Science,London U.K)搜庫(kù)軟件進(jìn)行比對(duì)可得蛋白序列的覆蓋率達(dá)98%,則可得該蛋白即為重組菌絲霉素蛋白。

        2.5?重組菌絲霉素蛋白體外抑菌活性的研究

        將重組菌絲霉素蛋白(700 mg/L)稀釋10、100倍后,測(cè)得其對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門(mén)氏菌抑制效果的數(shù)據(jù),用軟件SPSS21進(jìn)行數(shù)據(jù)分

        析,結(jié)果(表1)表明,重組菌絲霉素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌如金黃色葡萄球菌有抑制效果,且重組菌絲霉素的濃度越高抑制效果就越好,而重組菌絲霉素對(duì)革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的抑制效果非常的微弱,這與Mygind等的研究結(jié)果[4,8]相同。

        3?討論

        防御素是機(jī)體第一道防線的組成成分,屬于β折疊型抗菌肽,廣泛存在于各種生物中,對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒、腫瘤等均具有一定的抑制作用[11-12]。目前,制備防御素的途徑主要有天然提取、化學(xué)合成、基因工程表達(dá),因前2種獲取方法提取工藝復(fù)雜、成本高等,基因工程表達(dá)則成為獲取大量外源蛋白的主要方法[13]。畢赤酵母因?yàn)榫哂休^為完善的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、蛋白質(zhì)加工修飾能力且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素,所以廣泛用于產(chǎn)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)[14-15]。

        本試驗(yàn)提供一種獲取多量重組菌絲霉素及其表達(dá)載體構(gòu)建的方法,即根據(jù)目標(biāo)蛋白質(zhì)的氨基酸序列,對(duì)密碼子優(yōu)化并確定堿基序列,將含有MBP的基因序列與pGAPZaA表達(dá)載體相連接,并將重新組成的載體轉(zhuǎn)入到畢赤酵母細(xì)胞中,表達(dá)出所需要的菌絲霉素,對(duì)其進(jìn)行純化得到濃度為 700 mg/L,并對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果。根據(jù)Zhang等研究,菌絲霉素類似物NZ2114對(duì)金黃色葡萄球菌具有較高的專一性,抗菌效果可達(dá)到與青霉素與萬(wàn)古霉素相當(dāng)甚至更優(yōu)[16],則表明重組菌絲霉素都具有對(duì)金黃色葡萄球菌較強(qiáng)抑制效果的趨同性。

        抗菌肽被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的綠色飼料添加劑之一,與傳統(tǒng)抗生素相比,它具有無(wú)耐藥性和對(duì)人體無(wú)毒副作用,是抗生素理想的替代品之一[17]。近年來(lái),一些抗菌肽產(chǎn)品已投入到市場(chǎng)上銷售,表明抗菌肽應(yīng)用到飼料添加劑中正日漸變得廣泛,根據(jù)Ma等的研究,飼料中添加重組防御素可以顯著增加肉雞的平均日增質(zhì)量、降低料肉比,與空白對(duì)照組相比,血清免疫球蛋白M與免疫球蛋白G等含量都顯著增高,其脂肪酶與胰蛋白酶的活性也會(huì)增高[18]。根據(jù)李延等研究表明,在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加0.2%重組菌絲霉素可以顯著提高斷奶仔豬的平均日采食和平均日增質(zhì)量,其回腸中食糜雙歧桿菌的數(shù)量也顯著增加[19];此外,菌絲霉素也具有治療奶牛金葡菌乳腺炎的潛力[20]。

        根據(jù)這些研究結(jié)果可知,重組菌絲霉素作為飼料添加劑,對(duì)肉雞、仔豬等都具有較好的促生長(zhǎng)效果,甚至可作為藥制劑來(lái)治療某些疾病。該研究為產(chǎn)多量的菌絲霉素提供了更加廉價(jià)的途徑,同時(shí)也為綠色新型飼料添加劑的利用和開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

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