李林軒 梁瑩 覃犇 谷筱玉 韋范 韋坤華

摘要：對草珊瑚（Sarcandra glabra）進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁殖技術(shù)研究，建立草珊瑚的快速繁殖體系。結(jié)果表明，草珊瑚外植體的最佳消毒滅菌方法為使用75%乙醇消毒30 s，再用無菌水涮洗1遍，然后置于0.1%HgCl2溶液（加1～2滴表面活性物質(zhì)吐溫-80）浸泡消毒8～9 min，用無菌水浸洗2次，每次浸洗5 min。草珊瑚不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA;草珊瑚叢生芽繼代增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA。誘導(dǎo)草珊瑚生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA。草珊瑚試管苗移栽的最佳基質(zhì)為泥炭土+蛭石，比例為1 ∶1。

關(guān)鍵詞：草珊瑚;繁殖;叢生芽;生根;外植體消毒;不定芽誘導(dǎo);培養(yǎng)基

中圖分類號： S567.23+9.043文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0072-05

收稿日期：2019-09-25

基金項目：國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS21）;廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項資金（編號：桂科AA18242040）;廣西科技計劃（編號：桂科AD17129044）;廣西科技基地和人才專項（編號：桂科AD1850002、桂科2017AD19001）;“廣西八桂學(xué)者”專項（編號：桂藥創(chuàng)2019007;桂藥創(chuàng)2019005）;桂林市科技計劃項目重大專項（編號：20180102-4）。

作者簡介：李林軒（1986—），男，廣西全州人，碩士，高級工程師，從事中藥資源保護(hù)與開發(fā)利用研究。E-mail：175153419@qq.com。

通信作者：韋坤華，博士，研究員，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究。E-mail：divinekh@163.com。

草珊瑚[Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai]別稱腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶，為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物，整株入藥，具有清熱涼血、祛風(fēng)通絡(luò)、活血消斑等功效，用于治療血熱紫斑、紫癜、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷等癥[1]。此外，草珊瑚也是瑤族用藥的重點(diǎn)品種，是“五虎”“九?！薄笆算@”“七十二風(fēng)”等瑤藥老班藥中的風(fēng)藥品種之一。在廣西壯瑤地區(qū)，人們廣泛使用草珊瑚進(jìn)行清熱涼血，散淤消腫，祛風(fēng)通絡(luò)[2]。鑒于草珊瑚的良好療效，為了更好地開發(fā)和利用中藥草珊瑚資源，筆者對草珊瑚優(yōu)良植株進(jìn)行組織培養(yǎng)快繁技術(shù)研究，以利于草珊瑚野生資源的保護(hù)和優(yōu)良植株性狀的保持，為草珊瑚遺傳改良提高有效藥用成分打好基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

樣品采集自種植于廣西藥用植物園科研基地內(nèi)的健壯無病蟲害草珊瑚植株，原植物經(jīng)廣西藥用植物園韋坤華研究員鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚[Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai]，選取其嫩芽為外植體，于天氣晴朗的上午取樣。

1.2?試驗方法

1.2.1?外植體消毒

試驗以嫩芽芽尖作為外植體進(jìn)行初代誘導(dǎo)，首先將草珊瑚芽尖洗凈，用75%乙醇滅菌30 s，再用無菌水沖洗1遍，將洗干凈的草珊瑚芽尖置于0.1%HgCl2溶液（加1～2滴表面活性物質(zhì)吐溫-80）浸泡消毒5～10 min，用無菌水浸洗2次，每次浸洗5 min，用無菌紙將試驗材料表層的水分吸干，然后接種到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：平均光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時間12 h/d，溫度（25±3） ℃。

1.2.2?不定芽誘導(dǎo)

草珊瑚不定芽的誘導(dǎo)采用正交試驗設(shè)計，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）、IAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）、6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）進(jìn)行外源激素篩選，以獲得最佳的不定芽誘導(dǎo)條件，每個處理10瓶，每瓶4個外植體，培養(yǎng)30 d后記錄不定芽的誘導(dǎo)情況，比較不同處理對不定芽誘導(dǎo)的影響。

1.2.3?叢生芽繁殖

草珊瑚叢生芽繁殖優(yōu)化試驗是在MS培養(yǎng)基中進(jìn)行，采用正交試驗設(shè)計，添加 6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、IBA（0.1、0.2、0.4 mg/L）、AC（0、0.3、0.5 mg/L）3種外源激素，篩選不同外源激素對草珊瑚叢生芽繁殖的影響因子，30 d后觀察叢生芽的生長情況，統(tǒng)計增殖倍數(shù);芽增殖倍數(shù)=（30 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù)）/接種時芽數(shù)[3]，通過叢生芽生長情況與增殖倍數(shù)指標(biāo)來優(yōu)化繁殖培養(yǎng)基。

1.2.4?生根培養(yǎng)

以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基篩選出草珊瑚組培苗生根最佳培養(yǎng)基配方。采用正交試驗設(shè)計，在1/2MS培養(yǎng)基中添加IBA（0.2、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和AC（0、0.3、0.5 g/L）進(jìn)行試驗，每個處理10瓶，每瓶10個單芽，30 d后記錄生根率與生根數(shù)平均值，其中生根率=生根株數(shù)/接種總數(shù)×100%，生根數(shù)平均值=總生根數(shù)/接種總數(shù)×100%[4]，篩選草珊瑚試管苗生根效果最好的培養(yǎng)基。

1.2.5?煉苗及移栽

將生長旺盛、根系發(fā)達(dá)的草珊瑚試管苗移入常溫室內(nèi)放置，擰松瓶蓋馴化2 d后，打開蓋子讓草珊瑚試管苗與空氣完全接觸再馴化 3 d，期間定時向瓶內(nèi)的小苗噴霧以保持小苗葉片水分充足。馴化后，從瓶內(nèi)取出幼苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移入到黃沙、蛭石、泥炭、泥炭+蛭石（1 ∶1）、泥炭+黃沙（1 ∶1）5種不同基質(zhì)上，適度遮陰，并保持相對濕度在85%以上，30 d后統(tǒng)計不同基質(zhì)中組培苗的成活率[5]。

2?結(jié)果與分析

2.1?消毒時間篩選

為了確定消毒劑0.1% HgCl2消毒時間對外植體消毒效果的影響，對5、6、7、8、9、10 min 6個時間的消毒效果進(jìn)行比較研究，接種15 d后對試驗對象的污染率與成活率進(jìn)行統(tǒng)計與分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，草珊瑚消毒效果受其消毒時間影響明顯，隨著消毒時間的延長，草珊瑚污染率明顯下降。根據(jù)試驗結(jié)果，5 min內(nèi)草珊瑚的消毒效果不理想，污染率為100%;當(dāng)消毒時間增加到8 min時;消毒效果較好，成功率高達(dá)85%，而消毒時間延長到10 min時，消毒效果最好，污染率為0。但是，除了考慮污染率外，植物外植體消毒還需綜合考慮其存活率。根據(jù)試驗結(jié)果，隨著消毒時間的增加，成活率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其中成活率在 8 min 時最好，達(dá)到90%。綜合考慮不同消毒時間對草珊瑚外植體的污染率與成活率，當(dāng)消毒時間為8 min時，消毒效果最佳。

2.2?不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

將消毒后的芽尖接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d左右草珊瑚顏色逐漸變成乳黃色，其不定芽切口處開始增大并疏松，15 d左右在接觸培養(yǎng)基的基部長出不定芽，20 d時草珊瑚不定芽逐漸長出翠綠色葉片并且成簇生長，30 d統(tǒng)計增殖不定芽數(shù)，結(jié)果與分析見表2和表3。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果，當(dāng)6-BA濃度保持在1.0～1.5 mg/L的低濃度水平，不定芽數(shù)量隨著濃度增加而增加，不定芽粗壯、顏色新鮮翠綠;但當(dāng)6-BA濃度高于1.5 mg/L水平時，不定芽數(shù)量隨著濃度的增加反而逐漸下降，不

定芽有玻璃化現(xiàn)象且顏色變?yōu)辄S綠色，表明低濃度6-BA有利于草珊瑚不定芽的誘導(dǎo)，但高濃度對不定芽的誘導(dǎo)有抑制作用。根據(jù)試驗結(jié)果，草珊瑚不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基應(yīng)為A2B2C3，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA，以此培養(yǎng)基為基質(zhì)獲得的不定芽、粗壯、顏色呈翠綠色（圖1）。

2.3?叢生芽繼代

以0.5～1.0 cm的不定芽單芽為試驗材料，對草珊瑚叢生芽繁殖培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化篩選（表4、表5）。結(jié)果顯示，6-BA、IBA、AC 3種激素的影響順序為A（6-BA）>B（IBA）>C（AC），其中6-BA對叢生芽繁殖有極顯著影響，IBA產(chǎn)生顯著影響，AC對草珊瑚叢生芽繁殖影響不顯著。根據(jù)數(shù)據(jù)分析可見，3個因素的濃度對草珊瑚叢生芽增殖倍數(shù)的影響均具有先升高再降低的趨勢。6-BA濃度為1.5 mg/L、IBA濃度為0.3 mg/L時草珊瑚叢生芽增殖倍數(shù)最高（10.4），且芽苗為翠綠色，長勢較快，質(zhì)量也較好，有利于后期誘導(dǎo)草珊瑚生根。因此，根據(jù)上述試驗結(jié)果分析得出，草珊瑚叢生芽增殖的最適培養(yǎng)基應(yīng)為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA。 重復(fù)試驗發(fā)現(xiàn)在此培養(yǎng)基上叢生芽增殖頻率高，增值倍數(shù)達(dá)到最高值108，此時叢生芽的質(zhì)量也比其他處理好（圖2）。

2.4?叢生芽誘導(dǎo)生根試驗

為了篩選獲得最佳的生根培養(yǎng)基，使用IBA、NAA和活性炭（AC）3個水平設(shè)計正交試驗，將生長旺盛的單芽莖段接入草珊瑚生根培養(yǎng)基中，30 d后，統(tǒng)計草珊瑚生根率（表6、表7）。結(jié)果可知，3個因素對草珊瑚生根率的影響順序為A（IBA）>B（NAA）>C（AC），IBA對草珊瑚試管苗的生根率具有極顯著的影響（56.814），NAA對其生根率具有顯著影響（16.489），但AC對草珊瑚生根率無顯著影響（0.302）。IBA、NAA對草珊瑚生根率的影響呈現(xiàn)出在低濃度時促進(jìn)生根，而在高濃度時抑制生根。當(dāng)IBA濃度在0.5～1.0 mg/L、NAA濃度在0.1～0.3 mg/L濃度范圍時，草珊瑚試管苗生根率隨著濃度的上升而提高，但高于此濃度，生根率反而逐漸下降。經(jīng)過重復(fù)驗證，在1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA生根培養(yǎng)基上的生根率最高，達(dá)到100%（如圖3），因此，草珊瑚組培苗生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA。

2.5?試管苗的移栽

將試管苗的根洗凈并移植到5種不同的基質(zhì)上，分別為已消毒的黃沙、蛭石、泥炭、泥炭+蛭石（1 ∶1）、泥炭+黃沙（1 ∶1），適度遮陰，并保持一定的濕度，30 d后統(tǒng)計生根率，結(jié)果見表9。在5種不同的基質(zhì)處理中，草珊瑚試管苗都能成活，但成活率有較大差異。結(jié)果顯示，成活率高低的順序依次為泥炭+蛭石（1 ∶1）>泥炭+黃沙（1 ∶1）>黃 沙> 蛭石>泥炭。因此，泥炭+蛭石（1 ∶1）是移栽試管苗的最佳基質(zhì)，移栽30 d后成活率為96%（圖4）。

3?結(jié)論與討論

在植物組織培養(yǎng)中對試驗材料滅菌消毒取得無菌材料是至關(guān)重要的，本試驗對草珊瑚莖尖持續(xù)消毒滅菌處理在6～10 min范圍內(nèi)都能獲得無菌材料，滅菌時間為8 min，能夠到達(dá)最佳消毒滅菌效果，成功率為85%，滅菌時間高于或者低于8 min都不利于無菌材料的獲得。

組織培養(yǎng)中添加的生長調(diào)節(jié)劑，是誘導(dǎo)植物生芽、生根的關(guān)鍵因素，同時也是植物組織培養(yǎng)快速生長所必需[6]。在組織培養(yǎng)快速繁殖中，不同植物所需的生長調(diào)節(jié)劑的類型和濃度也不同[7-8]。本試驗通過對草珊瑚不定芽誘導(dǎo)、叢生芽繁殖及生根培養(yǎng)基進(jìn)行L9（34）正交試驗優(yōu)化篩選，從而建立草珊瑚組培苗快速繁殖體系。6-BA是植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域中非常重要的激素，可以促進(jìn)植物細(xì)胞分裂、側(cè)芽生長等[9]，并且對在草珊瑚不定芽誘導(dǎo)和叢芽誘導(dǎo)增殖具有極顯著影響，當(dāng)6-BA濃度為 15 mg/L 時效果最佳，如果濃度過高，則會抑制草珊瑚生長，這與王愛勤等在研究6-BA濃度對蘆薈組培苗增殖時發(fā)現(xiàn)高濃度6-BA會對蘆薈增殖產(chǎn)生抑制的研究結(jié)果[10]相一致。NAA具有促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大、誘導(dǎo)形成不定根等作用[11]，NAA對草珊瑚不定芽誘導(dǎo)生根有著顯著作用，低濃度NAA（低于0.3 mg/L）與生根率呈正相關(guān)關(guān)系，但大于0.3 mg/L，兩者就會出現(xiàn)負(fù)相關(guān)，表明NAA濃度過高會抑制叢生芽生根。植物可以自身形成的內(nèi)源生長素IBA，既可以促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和細(xì)胞生長，又可誘導(dǎo)不定根形成[12]。IBA對草珊瑚不定根誘導(dǎo)具有極顯著影響，低濃度IBA對草珊瑚不定根誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用，但高濃度具有抑制作用。試驗結(jié)果還表明，適宜的激素與生長素配比對草珊瑚不定根誘導(dǎo)與叢生芽增殖均具有良好的促進(jìn)作用，其中 6-BA與IAA、NAA的聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)，6-BA 與IBA的聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)草珊瑚叢生芽的增殖，而IBA與NAA的聯(lián)合應(yīng)用能促進(jìn)草珊瑚試管苗生根。

草珊瑚試管幼苗移植在不同基質(zhì)上的成活率也有一定差異，成活效果順序為泥炭+蛭石（1 ∶1）>泥炭+黃沙（1 ∶1）>黃沙>蛭石>泥炭。因此，草珊瑚試管苗移植到泥炭 ∶蛭石=1 ∶1的基質(zhì)中最好。

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