唐紅梅

摘要 溶菌酶在雞蛋清中的含量較為豐富，可以用較為簡易的方法制備。溶菌酶能催化水解細菌細胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的3-1，4糖苷鍵。測定溶菌酶活力時，可用溶壁微球菌細胞壁作底物，以單位時間內(nèi)被它水解的細胞壁的量表示酶活性的高低。通過紫外分光光度計可以直觀呈現(xiàn)酶活性變化，因酶活不同，A450nm的OD450 run值變化就不同。

關(guān)鍵詞 溶茵酶 溶壁微球菌細胞壁 紫外分光光度計

中圖分類號Q-331

文獻標(biāo)志碼B

人教版高中生物教材《必修1.分子與細胞》第五章第二節(jié)的探究實驗“影響酶活性的條件”要求學(xué)生根據(jù)教材所給的材料和試劑獨立設(shè)計實驗，來探究溫度與pH條件對兩種酶活性的影響。考慮到中學(xué)生的實驗水平以及中學(xué)實驗室的實際情況等因素，專家們在活動方案中建議使用淀粉酶探究溫度對酶活性的影響，使用過氧化氫酶探究pH對酶活性的影響。有教師采用了由學(xué)生自己從綠豆中提取的酶在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，用圓形濾紙片浸在不同的介質(zhì)中，用碘液檢驗淀粉被分解的狀況來反映酶活性。有教師利用注射器對實驗裝置和實驗方法進行優(yōu)化改進，并利用信息技術(shù)手段，實現(xiàn)師生之間有效的互動，使探究課落到實處的。有教師利用分光光度計創(chuàng)設(shè)實驗條件，并以問題串的方式引導(dǎo)學(xué)生設(shè)計實驗，學(xué)生通過探究影響酶活性的實驗，得到真實數(shù)據(jù)并轉(zhuǎn)換成曲線，完成建模。有教師在“溫度對酶活性的影響”實驗過程中借助了固體培養(yǎng)基及透明圈等大學(xué)微生物常用的酶活粗檢方法，創(chuàng)新實驗過程和觀察方法的。這些做法對于開拓學(xué)生視野、提高他們的科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新意識都具有重要意義。

但是用淀粉酶探究溫度對酶活性的影響，如果在較高溫度下加入碘液，又看不到變藍的現(xiàn)象。實際上“影響酶活性的實驗”從實驗設(shè)計上難度不大，學(xué)生利用所掌握的實驗設(shè)計方法，在教師的引導(dǎo)下完全可以根據(jù)實驗原理和要求，因地制宜地選用本地的經(jīng)濟實惠的實驗材料，或者說基于易于操作、實驗現(xiàn)象明顯的原則，自己設(shè)出實驗方案。例如，教師可以提議學(xué)生用木瓜乳汁制備木瓜蛋白酶，摸索使切成薄片的雞蛋白消失的酶液濃度和所需時間;嘗試用自制的雞蛋清溶菌酶水解溶壁微球菌測定酶活力的變化……這些實驗可以使學(xué)生認識到探究實驗和材料選擇具有多樣性，可以在實踐中基于需要進行材料、裝置或者試劑進行優(yōu)化和改進。因此，建議教師組織有興趣的學(xué)生開展課外拓展活動，發(fā)揮學(xué)生在學(xué)習(xí)中的主動性和創(chuàng)造性。

1 實驗原理

溶菌酶廣泛存在于動物、植物和微生物中，以雞蛋清中的含量較為豐富。溶菌酶能催化水解細菌細胞壁多糖的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的3-1，4糖苷鍵。

測定溶菌酶活力時，可用某些細菌細胞壁作底物，以單位時間內(nèi)被它水解的細胞壁的量表示酶活性的高低。酶活性越高，A450 nm的變化越快，反之越慢。

不同的溫度和pH可以改變酶的活性。

2 實驗材料及儀器

溶壁微球菌，紫外分光光度計。

3 實驗步驟

（1）取溶壁微球菌15 mg，加入pH6.2、物質(zhì)量濃度為0.1 mol/L的磷酸緩沖液2 mL，研磨成勻漿，定容至100 mL，配成OD450nm為0.6-0.7的懸浮液，于30℃保溫。

（2）制備雞蛋清溶菌酶：選擇蛋清的pH大于8.0的新鮮雞蛋，清潔雞蛋表面，蛋殼兩端敲洞取蛋清。輕輕攪勻蛋清，攪拌過程中避免起泡，以免影響溶菌酶活性及產(chǎn)率。雙層尼龍布過濾蛋清，濾去臍帶與蛋殼。按每升雞蛋清加入50 gNaCI的比例加鹽鹽析，置于冰上邊加邊攪拌。用1M的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為9.5-10.0，邊加邊攪拌，于4℃下靜止過夜至結(jié)晶析出。結(jié)晶過濾或離心，用丙酮洗滌結(jié)晶3次，常溫干燥。

（3）不同pH處理雞蛋清溶菌酶：將雞蛋清溶菌酶在室溫（25℃）下分別放在pH為4.5、6.5、8.5的的磷酸鹽緩沖溶液中0.5 h。不同溫度處理雞蛋清溶菌酶：將雞蛋清溶菌酶在pH為6.2的相同磷酸鹽緩沖液中，分別在25、65、10cC不同溫度下放置0.5 h。

（4）吸取2.5 mL己配置好的溶液至比色杯，加入0.1 mL雞蛋清溶菌酶酶液（預(yù)先用不同溫度或pH處理過），測定2 min內(nèi)A450 nm的變化（以0.1 mol/L磷酸緩沖液調(diào)零點），每30s記錄一次讀數(shù)。

（5）比較不同處理的各時段OD450 nm的變化值。

4 該實驗的優(yōu)點

不再使用豬肝實驗材料，同時也減少了實驗操作過程中加棉花塞試管的麻煩;試劑的使用量少;實驗可操作性強，花時少，誤差小，可重復(fù)性強;形象直觀地呈現(xiàn)出酶活性的高低變化。

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