◆作者：何楚俐胡豪井俊南黃靜朱曉彤潘木水

◆單位：1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所

集約化養(yǎng)殖過程中廣泛使用抗生素來維持動物體的健康和提高生長性能。抗生素的過度使用，已引起細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、藥物殘留、抗性基因污染等種種問題，并威脅到了人類自身的安全。1986年世界上第一個禁止將抗生素添加到畜禽飼料中的規(guī)定在瑞典實(shí)施，2006年歐盟亦開始全面禁止抗生素作為飼料添加劑使用。我國2020年藥物飼料添加劑將全面退出養(yǎng)殖環(huán)節(jié)，因此養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中尋求有效替代抗生素添加劑迫在眉睫。

植物精油是指從植物不同組織如果實(shí)、葉片、花和根中提取的具有強(qiáng)烈氣味和香味的揮發(fā)性液體（Stanborough Tamsyn等，2018），植物精油可以抑制有害菌的生長繁殖，甚至直接殺死有害菌達(dá)到抗菌作用（李文茹，2016），具有良好的替代抗生素的潛力。研究表明，飼料中添加植物精油可以改善畜禽肉質(zhì)、調(diào)節(jié)腸道菌群、提高免疫能力及生長速度等作用（DU E等，2016；Encun等，2016）。目前認(rèn)為植物精油中的抗菌活性物質(zhì)通過破壞細(xì)胞膜，促使細(xì)胞內(nèi)容物的流失，最終完成殺滅細(xì)菌的任務(wù)（楊寶玲等，2019）。有研究也表明精油可以增強(qiáng)豬的生產(chǎn)性能和消化率（常娟等，2019），提高家禽的免疫力（常娟，2017）。此外，精油還具有減少炎癥發(fā)生和抗氧化的作用，對肉雞的健康生長起到了關(guān)鍵作用。

本實(shí)驗(yàn)選擇了6種具有抑菌效果的植物精油：香芹酚、桂油、反式肉桂醛、肉桂醛、牛至油和丁香酚。通過抑菌圈法、最小抑菌濃度法（MIC），比較這6種植物精油對三種常見致病菌的抑菌效果，以期篩選出抑菌效果最佳的植物精油，為下一步開發(fā)植物精油替代抗生素的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

用于實(shí)驗(yàn)的6種植物精油分別是：桂油、牛至油、反式肉桂醛、肉桂醛、丁香酚和香芹酚，購于廣州建陽生物科技有限公司；3種常見致病菌：大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，來自廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所微生物菌種保藏室。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

壓力蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱、振蕩器，電子天平等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 適宜溶劑濃度的篩選

植物精油不溶于水，需要加入有機(jī)溶劑使其溶解。本實(shí)驗(yàn)選用乙醇作為植物精油的有機(jī)溶劑。但由于一定濃度的乙醇本身具有抑菌性，為了排除乙醇對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，設(shè)計40%、50%、60%、70%四個乙醇濃度用于篩選最適溶劑濃度。

1.2.2 菌株復(fù)蘇及菌懸液的制備

將上述三種供試菌種進(jìn)行斜面復(fù)蘇，復(fù)蘇后接種于固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)18h。直接從平板上挑取已純化的單個菌落，混懸于制備好的液體培養(yǎng)基中，制成濃度為108CFU/mL的菌懸液，備用。

1.2.3 不同濃度乙醇的抑菌效果的測定

鍵盤模塊采用動態(tài)掃描的方式，采用2個獨(dú)立式鍵盤，分別用于控制顯示環(huán)境溫度和目標(biāo)溫度。按鍵S1用于控制顯示環(huán)境溫度，按鍵S2用于控制顯示目標(biāo)溫度。其工作原理為： 單片機(jī)通過運(yùn)行程序不斷掃描鍵盤，檢查是否有鍵按下，當(dāng)掃描到有鍵按下時，調(diào)用相關(guān)程序完成對應(yīng)的操作。

用抑菌圈法（張卓然，1998）測定不同濃度的乙醇對三種致病菌的抑菌效果。首先利用傾注平板法將三種致病菌分別混于加熱冷卻至45℃的20mL LB培養(yǎng)基中，倒入已滅菌的9 cm培養(yǎng)皿中，冷卻后打孔。將上面配制好的不同濃度乙醇溶液，加到已打好的孔內(nèi)。放至恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。觀察結(jié)果。

1.2.4 不同植物精油體外抑菌效果的測定

用抑菌圈法測定6種植物精油的抑菌效果。首先從上述實(shí)驗(yàn)中選取最佳的乙醇濃度用作植物精油的溶劑。將三種致病菌分別混于加熱冷卻至45℃的20mL LB培養(yǎng)基中，利用傾注平板法倒入已干燥滅菌的直徑9 cm培養(yǎng)皿中，冷卻后采用瓊脂平板孔洞法用無菌金屬打孔器（d=4 mm）在培養(yǎng)皿上等距地打三個小孔，用鑷子挑出孔內(nèi)培養(yǎng)基后，每孔加入50μL已稀釋的植物精油（1μL/mL），放至恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24h。觀察結(jié)果。

1.2.5 不同植物精油體外最小抑菌濃度（MIC）的測定

選取上述試驗(yàn)中抑菌效果最好的植物精油作為后續(xù)試驗(yàn)所用的植物精油。采用試管梯度稀釋法測定最小抑菌濃度。取5支10mL的試管（編號1-5），每管加入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基3mL（1號管加入6mL液體培養(yǎng)基）。在1號管加入6μL植物精油，然后進(jìn)行梯度稀釋，使得1-5號管中最終植物精油范圍為0.0625～1μL/mL。最后向每個試管中加入50μL菌懸液。同時設(shè)置對照組：只加培養(yǎng)基和菌液，不含精油。置于37℃下培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，如培養(yǎng)基渾濁，說明有菌生長；對于臨界的透明試管，需要營養(yǎng)平板進(jìn)行檢驗(yàn)。將完全抑菌生長的最低植物精油濃度定義為最小抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜溶劑濃度的篩選

實(shí)驗(yàn)過程中，稀釋精油的乙醇濃度采用了以下四個濃度（40%、50%、60%、70%），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)乙醇的濃度小于等于50%時，對三種有害菌不產(chǎn)生抑菌效果。但考慮到乙醇具有揮發(fā)性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果所得可能偏大。同時考慮到實(shí)驗(yàn)操作具有不確定性，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用的乙醇濃度選定為40%。

2.2 不同植物精油體外抑菌效果的測定

表1 不同濃度乙醇的抑菌效果觀察

圖1 植物精油對三種致病菌的抑制作用

桂油對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果較好，對大腸桿菌的效果弱于前者。牛至油和丁香酚對三種有害菌的抑菌效果依次為沙門氏菌＞大腸桿菌＞金黃色葡萄球菌。反式肉桂醛和肉桂醛對三種有害菌的抑菌效果均比較接近。

表2 不同種類的植物精油對有害菌的抑菌效果觀察（n=3）

表3 香芹酚對致病菌的最小抑菌濃度效果

圖2 香芹酚對致病菌的最小抑菌濃度效果

香芹酚對三種有害菌的抑菌效果依次為大腸桿菌＞沙門氏菌＞金黃色葡萄球菌。

上述結(jié)果提示：實(shí)驗(yàn)中6種精油，香芹酚對三種有害菌的抑菌效果最好。

2.3 香芹酚對三種致病菌的最小抑菌濃度的結(jié)果

從表3和圖2可以看出，香芹酚對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果為：第3試管生長濃度為0.25μL/mL，培養(yǎng)后清澈無菌；第4試管渾濁，即有菌生長。對臨界的透明試管進(jìn)行營養(yǎng)平板進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無菌生長。所以香芹酚對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.25μL/mL。

3 討論

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，植物精油對于革蘭氏陰性菌（大腸桿菌、沙門氏菌）與革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）均有較好的抑菌效果。王新偉等研究表明，香芹酚、牛至油、肉桂醛和檸檬醛對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。甘盈盈等(2019)研究香芹酚對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）（USA300）的抑菌效果，測得香芹酚的MIC為128～256μg/mL，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。張修坤等（2019）的結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)一致，香芹酚的抑菌效果較丁香酚的好。胡艷芬等發(fā)現(xiàn)香芹酚對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及豬霍亂沙門氏菌等常見病原菌有很好的抑制和殺滅作用?？紤]到植物精油單獨(dú)使用時的效果未能完全替代抗生素，許多學(xué)者研究了將植物精油復(fù)配或與其它抑菌分子聯(lián)合起來使用的情況。張皓然等（2018）報道，植物精油與檸檬酸復(fù)合使用時具有協(xié)同作用，對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制效果。王康莉等(2019)將植物精油進(jìn)行復(fù)配，使用牛津杯法研究其抑菌效果，研究報道將肉桂醛與香蘭素按照4：1進(jìn)行復(fù)配時，對金黃色葡萄菌與沙門氏菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制效果。

4 結(jié)論

本研究表明六種植物精油均對致病菌有抑制作用，其中抑菌效果最好的是香芹酚，香芹酚抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小濃度抑菌為0.25μL/mL。