文超,王子楊,魯衛(wèi)星

心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion,I/R)損傷是指心肌在缺血/再灌注的過程中，由于再灌注而引發(fā)不可逆損傷的一種現(xiàn)象[1]。I/R損傷的作用機(jī)制目前尚未完全明確，抗心肌缺血/再灌注損傷的藥物研究和開發(fā)目前大多處于實(shí)驗(yàn)階段。

Oscar Langendorff 在1895年最早實(shí)現(xiàn)了哺乳動物離體心臟灌流，之后隨著這一實(shí)驗(yàn)方法的普及與發(fā)展，Langendorff離體心臟灌流被廣泛應(yīng)用在心臟缺血/再灌注的病理生理學(xué)研究中。該模型具有實(shí)驗(yàn)操作方便，費(fèi)用相對低廉，試劑制備簡單，實(shí)驗(yàn)因素相對容易控制，穩(wěn)定性較好，可重復(fù)性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，適合用作心臟缺血/再灌注損傷的研究。

三七為五加科植物三七的干燥根,具有散瘀止血，消腫定痛的功效。三七三醇皂苷(panaxatriol saponins,PTS)為較新的三七類藥物，其中主要活性成分人參皂苷Rg1的含量達(dá)60%以上,Rg1、R1、Re三者的總含量約達(dá)80%，在治療缺血性心腦疾病中具有廣泛的生物學(xué)功能[4]。

現(xiàn)通過Langendorff離體心臟灌流裝置建立大鼠心肌缺血/再灌注模型，研究PTS對大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷的作用，并探討其是否通過PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用，為PTS在心肌缺血再灌注損傷的臨床治療中提供一定理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動物：健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量250～300 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[合格證號：SCXK(京)2016-0006]。主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：Langendorff(澳大利亞AD Instruments Pty Ltd 實(shí)驗(yàn)室，ML870B2)、多導(dǎo)生理儀(美國Biopac MP150)。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 模型建立：取大鼠稱重，以1×103U/kg腹腔注射肝素，充分肝素化后以1 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉。在大鼠充分麻醉之后，將其置于手術(shù)臺上固定，開胸，并充分暴露主動脈弓，用鑷子夾緊主動脈弓分支前的位置，在主動脈弓以下位置剪斷主動脈，剪下完整心臟，迅速放入裝有0℃預(yù)冷K-H液的平皿中[5]，并去血。提前將蠕動泵流速調(diào)為10 ml/min，排凈Langendorff裝置管內(nèi)氣體，以避免連接時(shí)空氣進(jìn)入主動脈。迅速用鑷子夾持主動脈管壁，并將灌注管插入主動脈中，用0號線在主動脈和灌注管連接處打結(jié)以固定心臟，逆行灌入含有95% O2和5% CO2的37 ℃ K-H液，剪開右心耳，以便灌流液流出，以此狀態(tài)平衡20 min。待心臟穩(wěn)定復(fù)跳，剪開左心耳，經(jīng)左心耳破開二尖瓣，將心室內(nèi)壓球囊放入左心室，測試導(dǎo)管通過壓力感受器連接多導(dǎo)生理儀，記錄全程心臟電生理活動。入組標(biāo)準(zhǔn)：心律齊，心率≥220次/min，左室收縮壓≥60 mmHg。后依據(jù)分組情況給予不同操作及給藥。

1．2．2 分組及給藥：應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將40只健康雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，各8只。(1)對照組：只穿線不結(jié)扎，以K-H液持續(xù)灌流105 min。(2)模型組(I/R)：穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支近分支處，令左前降支局部停灌30 min，后開放結(jié)扎線，K-H液復(fù)灌75 min。(3)PTS組(I/R+PTS)：穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支近分支處30 min，以含10 mg/L PTS(由成都華神藥業(yè)股份有限公司提供)的K-H液復(fù)灌75 min。(4)LY294002組(I/R+LY294002)：穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支近分支處30 min，以含15 μmol/L LY294002的K-H液復(fù)灌75 min(LY294002為PI3K/Akt信號通路的特異性阻滯劑)。(5)LY294002 +PTS組(I/R+LY+PTS)：穿線結(jié)扎冠狀動脈左前降支近分支處30 min，先以含15 μmol/L LY294002的K-H液復(fù)灌 15 min，再以含10 mg/L PTS的K-H液復(fù)灌60 min。

1.3 觀察指標(biāo)與方法 (1)通過多導(dǎo)生理儀記錄全程心率(HR)、左心室收縮末壓(LVESP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)等心功能指標(biāo)。(2)收集各組平衡灌注20 min、局部停灌30 min、再灌15 min、再灌75 min的灌流液，并測量心肌酶學(xué)指標(biāo)肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)。(3)取左心室梗死邊緣區(qū)心肌組織行免疫組化分析心肌組織Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)情況，采用染色強(qiáng)度結(jié)合陽性細(xì)胞百分比綜合計(jì)分，組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)志。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特性記分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比即5個(gè)視野陽性心肌細(xì)胞平均數(shù)：0～5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。每組取3張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)400倍視野，每個(gè)視野計(jì)分為染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比分?jǐn)?shù)的乘積，結(jié)果平均后取整數(shù)：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。(4)Western-blot法檢測各組絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、糖原合成激酶-3β(GSK-3β)、磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的蛋白表達(dá)，并用Image-J軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析[6]。

2 結(jié) 果

2.1 各組血流動力學(xué)參數(shù)比較 通過多導(dǎo)生理儀記錄心臟的血流動力學(xué)參數(shù)，并將各組4個(gè)時(shí)刻的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，并計(jì)算與平衡末變化量占比[平衡末變化量占比=(平衡灌注20 min-再灌注75 min)/平衡灌注20 min]×100%，見表1、圖1。

HR比較：對照組4時(shí)刻無明顯變化(P>0.05)，其余各組均不同程度上升，且除對照組外其余4組在再灌注75 min時(shí)無明顯差異(P>0.05)。LVESP、LVEDP、LVDP、±dp/dt max比較：對照組4時(shí)刻無明顯變化或少量下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。其余各組隨時(shí)間延長出現(xiàn)不同程度下降，提示缺血再灌注損傷會造成左心室收縮、舒張功能的下降。再灌注75 min時(shí)，PTS組變化量占比明顯低于模型組(P<0.05)。而LY+PTS組與模型組無明顯差異，與PTS組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組心肌酶學(xué)參數(shù)比較 CK-MB、LDH組內(nèi)比較：除對照組外，各組再灌注后心肌酶漏出量均較同組局部缺血30 min有顯著提升(P<0.05)。組間比較：各組平衡20 min時(shí)心肌酶漏出量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；局部缺血30 min時(shí)，各組CK-MB比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而LDH各組較對照組有所升高(P<0.05)；再灌注15 min、75 min時(shí)，各組均顯著高于對照組(P<0.05)，PTS組明顯低于I/R組(P<0.05)，LY+PTS組高于PTS組(P<0.05)，見表2。

表1 各組血流動力學(xué)參數(shù)變化量占比變化比較

表2 各組灌流液中CK-MB和 LDH水平比較

2.3 各組Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β的表達(dá)比較 Western-blot結(jié)果顯示，經(jīng)過I/R損傷后，各組心肌組織Akt、GSK-3β表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，LY294002組、LY+PTS組心肌組織p-Akt、p-GSK-3β表達(dá)較I/R組顯著下降(P<0.05)，PTS組表達(dá)較I/R組顯著提高(P<0.05)，見圖2。

2.4 免疫組化法分析Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，I/R組Bax、Caspase-3陽性表達(dá)顯著高于對照組，PTS組和LY+PTS組Bax、Caspase-3陽性表達(dá)較I/R組低。I/R組Bcl-2強(qiáng)陽性表達(dá)顯著低于對照組，PTS組較I/R組顯著提高，LY+PTS組顯著低于PTS組(P<0.05)，見圖3。

3 討 論

迄今為止，對于急性心肌梗死最為有效且快速的治療方式仍是心肌再灌注[7]。然而再灌注帶來的損傷目前尚無有效的措施可以減輕或預(yù)防[8]。磷酸肌醇—蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路是一種廣泛存在的信號通路，已經(jīng)被大量研究證實(shí)其參與了多種細(xì)胞生理活動。Akt是PI3K下游最重要的中心調(diào)節(jié)分子之一，p-Akt為磷酸化活化形式，大量研究已經(jīng)證實(shí)，其可以通過調(diào)控、激活下游分子，發(fā)揮生物學(xué)功能，如p-Akt可以調(diào)控下游分子GSK-3β的磷酸化，減少Caspase-3的活化，對心肌缺血/再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)作用[9-11]；也可以激活Bcl-2，減少Bax的活化，穩(wěn)定線粒體的內(nèi)外膜，發(fā)揮抗凋亡的作用，從而緩解心肌缺血/再灌注損傷[12]。

注：與I/R組比較，a P<0.05；與PTS組比較，b P<0.05

圖3 各組免疫組化染色情況(IHC染色，×400)

PTS作為在心腦血管疾病中擁有廣泛生物學(xué)功能的藥物[4]，是否能夠在心肌缺血/再灌注損傷中發(fā)揮積極作用證據(jù)尚顯不足。因此，本實(shí)驗(yàn)研究中，采用Langendorff離體心臟灌流裝置，構(gòu)建大鼠心臟缺血/再灌注模型進(jìn)行研究與探討。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，灌流液中給予10 mg/L的PTS處理，可以顯著減輕缺血/再灌注帶來的心肌損傷，具體體現(xiàn)在以下2個(gè)方面：(1)減少心肌酶的釋放。CK-MB和 LDH是心肌細(xì)胞中存在的兩類心肌酶，在心肌細(xì)胞受損時(shí)向外釋放增加。血清中CK-MB和LDH的升高可以作為衡量心肌缺血/再灌注損傷程度的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，心肌缺血/再灌注可以引起心肌酶CK-MB和LDH釋放增多，而PTS可以有效減少CK-MB和LDH的漏出，減少缺血/再灌注對心肌細(xì)胞的損傷。此外，在PI3K/Akt通路特異性阻滯劑LY294002的作用下，PTS減少心肌酶漏出的作用一定程度上下降，與單用PTS組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，提示PTS可能通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮作用。(2)改善左心室功能。在血流動力學(xué)參數(shù)中，LVESP、LVDP、+dp/dt max可以評價(jià)左心室的收縮功能，LVEDP、-dp/dt max可以評價(jià)左心室的舒張功能，HR可以評價(jià)左心室的心肌耗氧量[13]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，心肌缺血/再灌注可以導(dǎo)致左心室收縮、舒張功能降低，而PTS具有改善左心室收縮、舒張功能的作用，并且在LY294002預(yù)處理下該作用顯著降低。提示PTS可能通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮作用。而除對照組外其余4組在再灌注75 min時(shí)HR比較無明顯差異(P>0.05)，提示PTS對心肌耗氧量變化無明顯效果。

Western-blot法與免疫組化染色結(jié)果顯示，PTS可能通過PI3K/Akt信號通路增加Akt的磷酸化表達(dá)，從而增加GSK-3β的磷酸化，減少Caspase-3的活化；還可以激活Bcl-2，減少Bax的活化，使線粒體內(nèi)外膜保持穩(wěn)定，實(shí)現(xiàn)抗凋亡的作用，從而緩解心肌缺血/再灌注損傷。

綜上所述，PTS可以減輕心肌缺血/再灌注損傷，其作用的實(shí)現(xiàn)可能與其激活PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明：

文超：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，論文撰寫；王子楊：資料搜集整理，實(shí)施研究過程，論文撰寫，論文修改；魯衛(wèi)星：提出研究思路，論文審核