楊麗瑋,盧佩佩 ,西麗娜依·買買提,郭淑麗
布氏桿菌病是由布氏桿菌感染引起的人畜共患傳染病,其主要通過消化道、皮膚裂隙、疤痕及吸入的粉塵感染人體,引起多系統(tǒng)、多器官損害[1]。免疫受體T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結構域3(Tim-3)在T細胞介導的免疫應答和細胞凋亡中發(fā)揮重要作用,在機體慢性病毒感染、腫瘤免疫逃逸中扮演關鍵的角色[2]。而高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種非組蛋白,位于細胞核中,由瀕死細胞、癌細胞和免疫細胞分泌,是Tim-3的配體,在布氏桿菌感染者細胞表面上高表達的免疫受體Tim-3,誘導機體產生多種細胞因子、趨化因子和活性氧等,進而導致炎性反應或細胞組織損傷[3]。然而,目前尚未闡明Tim-3/HMGB1在布氏桿菌感染者中的表達變化,以及其與相關細胞因子水平變化的關系,基于此,分析布氏桿菌感染者體內Tim-3/HMGB1與相關細胞因子的變化,為布魯氏感染者治療提供新的靶點,報道如下。
1.1 臨床資料 選取2017年10月—2018年10月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院感染科住院布氏桿菌感染者32例作為布病組,男21例,女11例,年齡22~62(37.45±7.22)歲;病程3~10(4.76±2.15)個月;有明確接觸史25例(78.12 %),其中屠宰工作人員4例,養(yǎng)殖人員14例,疾控人員7例;臨床分期:急性期25例,慢性期7例;既往治療史14例;合并癥:睪丸炎18例,卵巢炎9例,心、腎及神經系統(tǒng)受累表現者5例。同時選取同期于醫(yī)院體檢的正常人30例作為健康對照組,男19例,女11例,年齡22~65(38.27±6.87)歲;2組性別、年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。均衡可比。本研究經醫(yī)院倫理委員會審核批準,受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。
1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①均符合布氏桿菌病診療指南(試行)與布氏桿菌病診斷標準(WS 269—2019)[4-5];②均追蹤隨訪檢測2個月以上。(2)排除標準:①結核、敗血癥、傷寒、副傷寒、風濕熱等疾病者;②資料不完整者;③中途退出者。
1.3 觀測指標與方法
1.3.1 血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及干細胞因子(SCF)水平的檢測:采集2組研究對象的外周血清3 ml,置于-80 ℃冰箱中備用。使用賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產的熱電MK3酶標儀,以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及SCF水平。檢測操作嚴格按照賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供的試劑盒說明書進行。
1.3.2 TGF-β水平檢測:采用酶聯免疫斑點法檢測研究對象的外周血單個核細胞(PBMC)中TGF-β的斑點形成細胞數(SFC)。采抗凝血3 h內分離PBMC,在包被特異性抗人TGF-β抗體的96孔酶聯免疫斑點板,每孔加入100 μl培養(yǎng)液調至終濃度為2×105個PBMC。每份PBMC樣本加3個孔,磷酸緩沖鹽溶液(PBS)100 μl為陰性對照孔,終濃度為5 μg/ml植物血凝素(PHA)為陽性對照孔,終濃度為5 μg/ml布氏桿菌重組蛋白抗原(BCSP31)為實驗刺激孔,置37 ℃、5%含量的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。酶聯免疫斑點板置于德國BIOSYS公司提供的YZ-2000 C 型酶聯斑點分析儀,調參數,計數。
2.1 2組血清Tim-3、HMGB1水平比較 布病組Tim-3、HMGB1水平高于健康對照組(P<0.01),見表1。
表1 2組受試者血清Tim-3、HMGB1水平比較
2.2 2組血清TNF-α、IL-1β及SCF水平比較 布病組血清TNF-α、IL-1β及SCF水平均高于健康對照組(P<0.01),見表2。
表2 2組受試者血清TNF-α、IL-1β及SCF水平比較
2.3 2組PBMC中分泌TGF-β的SFC比較 布病組中采用BCSP31為實驗刺激孔TGF-β的SFC明顯多于健康對照組,而2組中陰性與陽性對照孔TGF-β的SFC比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表3、圖1、圖2。
布氏桿菌侵入機體后被吞噬細胞吞噬,逐步形成感染灶、菌血癥,隨后入侵人體重要臟器而大量繁殖,導致臨床表現為波浪熱,伴隨關節(jié)痛和全身乏力等癥狀[1]。Tim-3蛋白作為促炎性刺激參與靶細胞的信號傳導,在炎性反應中發(fā)揮重要的作用。HMGB1是一種非組蛋白,位于細胞核內,與DNA結合以促進核轉錄過程。此外,轉化生長因子-β(TGF-β)在炎性反應、組織修復和胚胎發(fā)育等方面的生物學功能進行研究發(fā)現,TGF-β對細胞的生長、分化和免疫功能也有重要的調節(jié)作用[6]。而HMGB1會觸發(fā)布氏桿菌病患者釋放TNF-α,進而誘導白細胞產生白介素1β(IL-1β),導致IL-1β誘導感受態(tài)細胞分泌SCF[7]。
表3 2組受試者PBMC中分泌TGF-β的SFC比較
注:與健康對照組比較,a P<0.01
此外,最近發(fā)現HMGB1在響應內源性和/或外源性刺激(例如缺氧、內毒素等)情況下產生異常的蛋白質,可能被免疫系統(tǒng)識破,容易發(fā)生細胞死亡,瀕死/受傷的細胞被動釋放或由免疫/癌細胞分泌時起損傷相關分子模式的作用[8]。此過程之后,HMGB1參與觸發(fā)靶細胞中的信號傳導事件。因此,其可作為受應激源影響的細胞分泌的因子[9]。研究發(fā)現,在急性髓細胞性白血病期間,HMGB1水平顯著升高[10]。最近的證據表明,HMGB1與免疫受體Tim-3可能在重度顱腦損傷、NK細胞上的表達增加[11-12]。由Tim-3觸發(fā)的信號傳導途徑影響TNF-α等炎性細胞因子,與宿主免疫防御和造血的控制有關[13-14]。本研究結果顯示,布氏桿菌感染者血清Tim-3、HMGB1、TNF-α、IL-1β及SCF水平上升,這提示以上指標水平高低與布氏桿菌感染情況存在一定的聯系。
TGF-β可以通過調節(jié)細胞因子、分子及其各自受體表達的間接機制來影響細胞分化[15]。這些反應強烈影響一系列細胞類型的生長和表型。TGF-β活性過高或降低可能分別導致纖維化疾病和過度增殖性疾病[16]。本研究顯示,PBMC中分泌TGF-β的SFC顯著較高,間接提示布氏桿菌感染者存在受體表達的免疫應答調控機制。蛋白質復合物的形成伴隨著α-螺旋含量的增加,而β-鏈的損失可能主要來自Tim-3蛋白。生物學測試表明,以HMGB1依賴性方式從布氏桿菌感染者細胞釋放的TNF-α能夠誘導原代人健康白細胞分泌IL-1β。與本研究的觀察結果相符,后者表明響應HMGB1刺激的TNF-α和IL-1β分泌均上調[17]。該反應是布氏桿菌感染者進展中非常重要的一步,因為IL-1β與Ⅰ型IL-1受體相互作用,并誘導布氏桿菌感染者細胞增殖所需的SCF產生和分泌[18]。布氏桿菌感染者細胞表達可識別SCF的Kit受體,但由于AML細胞能夠誘導健康細胞產生SCF,因此這種造血因子具有高度致癌性,在原代小鼠骨髓細胞中看到了相同的效果。當暴露于HMGB1時,TNF-α、IL-1β和SCF的水平升高,表明HMGB1也可以在骨髓中誘導這種作用[1]。這與本結果顯示布氏桿菌感染者Tim-3、HMGB1水平較高,同時TNF-α、IL-1β及SCF水平上升一致。因此, HMGB1作為Tim-3和其他免疫受體的配體對布氏桿菌感染者進展至關重要。
綜上所述,布氏桿菌病患者血清Tim-3/HMGB1均增加,且在布氏桿菌抗原刺激后形成TGF-β的斑點形成細胞數明顯增加,這可能導致布氏桿菌感染過程免疫應答提升,不利于機體對布氏桿菌的有效清除。
圖2 2組PBMC中分泌TGF-β的SFC斑點實驗
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻聲明
楊麗瑋、盧佩佩:設計研究方案,實施研究過程,資料搜集整理,分析試驗數據,論文撰寫;西麗娜依·買買提、郭淑麗:提出研究思路,課題設計,分析試驗數據,論文修改,論文審核