趙利，馬向明，王瑛，吉瑞更，付慶江，曹立瀛

肝癌在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第二，早期肝癌患者及時(shí)診斷預(yù)后良好，5年生存率> 70%，若肝癌進(jìn)入晚期， 5年生存率<16%[1-3]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑，是一種復(fù)雜的分解代謝過程，涉及長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)的循環(huán)和分解，以及細(xì)胞內(nèi)無用細(xì)胞器的降解。作為細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑，自噬與腫瘤細(xì)胞的存活相關(guān)[4-5]。越來越多的證據(jù)表明，在各種抗癌藥誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中，細(xì)胞凋亡和自噬之間存在復(fù)雜的功能關(guān)系。竹節(jié)香附素A具有抗炎、抗腫瘤和抗菌能力，其通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)治療作用[6-7]。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，竹節(jié)香附素A誘導(dǎo)自噬，通過降低耐藥性來殺傷癌細(xì)胞?；钚匝?ROS)是自噬相關(guān)的上游細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)自噬激活激酶1 (ULK1)/自噬相關(guān)蛋白13(Atg13)過表達(dá)進(jìn)而激活自噬通路[8]。本研究擬探討竹節(jié)香附素A通過ULK1/Atg13及ROS途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞自噬的作用，為肝癌的治療提供理論依據(jù)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)18091603。(2)試藥試劑： L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；竹節(jié)香附素A購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；5氟尿嘧啶、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、吖啶橙染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)sigma公司；HEPES緩沖液、裂解緩沖液、BCA蛋白法含量測(cè)試盒、5%牛血清白蛋白(BSA)、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)、TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)NEB公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本Takara公司；PVDF膜購(gòu)自北京明陽科華生物科技有限公司；ULK1、Atg13、β-actin一抗購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。(3)儀器：MK-9型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司；Olympus CKX31型熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司；XC-987型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司；QuantStudio5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；LAS3000型顯影儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.2 肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 2019年8—9月于開灤總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肝癌HepG2細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基， 在37℃、5%CO2的正常培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。分組：肝癌HepG2細(xì)胞組、5-氟尿嘧啶組、竹節(jié)香附素A低劑量組、竹節(jié)香附素A高劑量組，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中干預(yù)組分別加入5氟尿嘧啶(濃度為80 mg/μl，預(yù)試驗(yàn)求出5氟尿嘧啶的LC50為160 μg/ml，以1/2 LC50為作用劑量)、不同劑量的竹節(jié)香附素A，竹節(jié)香附素A低、高劑量分別為100、200 mg/μl。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣，培養(yǎng)72 h。

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 細(xì)胞增殖水平測(cè)定：將肝癌HepG2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中，與無血清培養(yǎng)基孵育4 h，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞存活率，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

1.3.2 細(xì)胞自噬檢測(cè)：通過吖啶橙染色觀察自噬情況。將HepG2細(xì)胞(6×105個(gè)/孔)接種到18 mm×18 mm蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中，并用磷酸緩沖液4 μl處理72 h，然后沖洗并用吖啶橙(10 mg/L)在37℃染色持續(xù)30 min，蓋上蓋玻片后，使用熒光顯微鏡觀察樣品，以評(píng)估從綠色到紅色的顏色變化。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)酸性自噬小體(紅色)，說明細(xì)胞發(fā)生自噬，為陽性細(xì)胞；細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光，說明細(xì)胞未發(fā)生自噬，為陰性細(xì)胞。于高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)自噬小體個(gè)數(shù)。

1.3.3 肝癌HepG2細(xì)胞凋亡檢測(cè)：各組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收獲細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌1次并離心，使用膜聯(lián)蛋白V/PI雙染色的流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。將全細(xì)胞收集在HEPES緩沖液(pH 7.4的10 mmol/L HEPES，140 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2)中，隨后，用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)(2.5 μg/ml)和PI(2 ng/ml)染色細(xì)胞20 min，然后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析，使用Cell Quest軟件分析凋亡水平，早期凋亡(膜聯(lián)蛋白V+/PI-)和晚期凋亡(膜聯(lián)蛋白V+/PI+)的總和為總細(xì)胞凋亡。

1.3.4 細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA水平測(cè)定： TRIzol試劑分離肝癌HepG2細(xì)胞總RNA，使用ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行定量PCR分析，制備20 μl反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，將靶基因的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列：ULK1正向5'-CGGTAGTTTGCCGTGAGTGA-3'，反向5'-CCGTGACGCTCCCGTGGATG-3'；Atg13正向5'-CCGTGTGATTGGCTTCCGCCGTGAC-3'，反向5'-CCTGTGTGACTCCCTGCCGTGGAGT-3'；β-actin正向5'-CCAGGAAAAGGTGTGAAATC-3'，反向5'-AAGCGCTTGGTGGTCAGATT-3'。反應(yīng)條件：95℃ 15 s，95℃ 10 s，60℃ 5 s，72℃ 35 s，并擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。并使用2-△△Ct方法確定ULK1、Atg13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 細(xì)胞ULK1、Atg13蛋白水平測(cè)定：收集肝癌HepG2細(xì)胞，將所有細(xì)胞在冰上用裂解緩沖液裂解30 min，并將細(xì)胞碎片在4℃下離心，通過BCA蛋白法含量測(cè)試盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。使用二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)在12V電壓下分離，而后將其印跡到PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂干乳液在5%牛血清白蛋白封閉膜2 h。將PVDF膜與ULK1、Atg13、β-actin一抗(稀釋比1∶1 000)在4℃下孵育24 h，在BSA中洗滌PVDF膜3次，持續(xù)10 min，在37℃下將辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗(稀釋比1∶2 000)孵育1 h，在BSA中洗滌PVDF膜3次，持續(xù)10 min。使用化學(xué)發(fā)光ECL測(cè)定試劑盒檢測(cè)各蛋白質(zhì)，使用LAS3000型顯影儀顯示W(wǎng)estern印跡，通過MultigaugeV3.0軟件應(yīng)用圖像分析檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.3.6 ROS檢測(cè)：ROS水平通過2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Beyotime)測(cè)量。讓96孔板上的肝癌HepG2細(xì)胞附著過夜，然后用相應(yīng)藥物處理24 h，除去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，然后與DCFH-DA在37℃下溫育30 min，通過酶標(biāo)儀測(cè)量488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)的ROS水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組肝癌HepG2細(xì)胞OD值、存活率比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞OD值、存活率降低(t/P=15.639/0.000、21.547/0.000、18.541/0.000、26.324/0.000、18.514/0.000、16.852/0.000)；與5-氟尿嘧啶組比較，竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞OD值、存活率升高(t/P=21.214/0.000、19.547/0.000、18.547/0.000、25.478/0.000)；與竹節(jié)香附素A低劑量組比較，竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞OD值、存活率降低(t/P=16.547/0.000、23.547/0.000)，見表1。

表1 各組肝癌HepG2細(xì)胞OD值、存活率比較

2.2 各組肝癌HepG2細(xì)胞自噬小體水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組(63.54±12.54個(gè))比較，5-氟尿嘧啶組(598.54±15.64個(gè))、竹節(jié)香附素A低劑量組(290.47±17.54個(gè))、高劑量組(483.65±15.69個(gè))自噬小體數(shù)升高(t/P=10.547/0.000、16.547/0.000、20.547/0.000)；與5-氟尿嘧啶組比較，竹節(jié)香附素A低、高劑量組自噬小體數(shù)降低(t/P=16.325/0.000、22.547/0.000)；與竹節(jié)香附素A低劑量組比較，竹節(jié)香附素A高劑量組自噬小體數(shù)升高(t/P=15.696/0.000)，見圖1。

2.3 肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率(0.90±0.24)%比較，5-氟尿嘧啶組(10.80±0.26)%、竹節(jié)香附素A低劑量組(2.30±0.23)%、高劑量組(9.00±0.29)%升高(t/P=12.321/0.000、25.547/0.000、19.541/0.000)；與5-氟尿嘧啶組比較，竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞凋亡率降低(t/P=9.874/0.000、16.589/0.000)；與竹節(jié)香附素A低劑量組比較，竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞凋亡率升高(t/P=10.654/0.000)，見圖2。

2.4 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平升高(t/P=25.654/0.000、15.987/0.000、23.547/0.000、18.654/0.000、18.547/0.000、16.547/0.000)；與5-氟尿嘧啶組比較，竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平降低(t/P=13.654/0.000、14.654/0.000、16.589/0.000、21.247/0.000)；與竹節(jié)香附素A低劑量組比較，竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平升高(t/P=14.697/0.000、18.324/0.000)，見表2。

表2 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平比較

2.5 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13蛋白表達(dá)水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13蛋白表達(dá)水平升高(t/P=18.741/0.000、16.547/0.000、17.548/0.000、16.547/0.000、15.847/0.000、20.478/

0.000)；與5-氟尿嘧啶組比較，竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 蛋白表達(dá)水平降低(t/P=21.687/0.000、18.324/0.000、18.541/0.000、19.587/0.000)；與竹節(jié)香附素A低劑量組比較，竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 蛋白表達(dá)水平升高(t/P=17.024/0.000、19.634/0.000)，見表3、圖3。

表3 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13 蛋白表達(dá)水平比較分)

注：A.肝癌HepG2細(xì)胞組；B.5-氟尿嘧啶組；C.竹節(jié)香附素A低劑量組；D.竹節(jié)香附素A高劑量組

肝癌HepG2細(xì)胞組 5-氟尿嘧啶組 竹節(jié)香附素A低劑量組 竹節(jié)香附素A高劑量組

肝癌HepG2細(xì)胞組 5-氟尿嘧啶組 竹節(jié)香附素A低劑量組 竹節(jié)香附素A高劑量組

2.6 各組肝癌HepG2細(xì)胞ROS水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組ROS水平(51.08±1.13)mol/ml比較，5-氟尿嘧啶組(59.89±1.23)mol/ml、竹節(jié)香附素A低劑量組(54.14±1.27)mol/ml、高劑量組(56.56±1.36)mol/ml升高(t/P=13.254/0.000、18.524/0.000、16.254/0.000)；與5-氟尿嘧啶組比較，竹節(jié)香附素A低、高劑量組ROS水平降低(t/P=19.654/0.000、24.052/0.000)；與竹節(jié)香附素A低劑量組比較，竹節(jié)香附素A高劑量組ROS水平升高(t/P=18.547/0.000)。

3 討 論

竹節(jié)香附素A具有多種生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性。研究表明，竹節(jié)香附素A是Bcl-2蛋白表達(dá)的有效抑制劑，是各種腫瘤中抗凋亡蛋白的抑制劑[9]。竹節(jié)香附素A在多種癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在人類肺癌細(xì)胞中，竹節(jié)香附素A可以抑制癌細(xì)胞遷移和入侵。竹節(jié)香附素A還可抑制炎性因子核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)，而腫瘤血管生成與炎性反應(yīng)密切相關(guān)；竹節(jié)香附素A也可抑制腫瘤血管生成[10]。這些結(jié)果表明，竹節(jié)香附素A可能具有抗腫瘤治療的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)，與肝癌HepG2細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組OD值、存活率降低，細(xì)胞自噬小體、凋亡率水平升高。這提示竹節(jié)香附素A能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬及凋亡。細(xì)胞凋亡和自噬是程序性細(xì)胞死亡的2種重要類型。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是殺死腫瘤細(xì)胞的主要分子機(jī)制，其有2種信號(hào)通路，包括外源和內(nèi)源通路[11-14]。內(nèi)在凋亡途徑，也稱為線粒體啟動(dòng)途徑，與細(xì)胞色素C(Cyto-C)釋放到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，后者激活下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)，包括Atg13，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究已發(fā)現(xiàn)[15]，在胃癌細(xì)胞中，竹節(jié)香附素A通過激活Caspase信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，這與本研究結(jié)果一致。

自噬是將細(xì)胞質(zhì)材料遞送至溶酶體以降解的過程。超過30個(gè)基因參與自噬，其稱為Atg。Atg13是雷帕霉素(TOR)激酶信號(hào)通路的靶點(diǎn)，通過Atg13和ULK1的磷酸化及ULK1/Atg13復(fù)合物的調(diào)節(jié)來影響自噬[16-19]。此外，近年來越來越多的證據(jù)表明，ULK1具有抗增殖活性。當(dāng)ULK1用作腫瘤抑制因子表達(dá)時(shí)，它主要定位于細(xì)胞質(zhì)；當(dāng)ULK1抑制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí)，它會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核中[20]。數(shù)據(jù)表明，ULK1通過抑制增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白來抑制食管組織細(xì)胞核中的增殖。此外，ULK1通過p53依賴性途徑在腎上皮細(xì)胞(HEK293)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HepG2)和人乳腺癌(MDA-MB-231、MCF-73)中顯示出顯著的抗增殖作用[21-22]。在體外細(xì)胞研究中，CCK-8和細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)表明，過表達(dá)ULK1可以有效抑制A549和H1299肺癌細(xì)胞的增殖。Atg13是腫瘤抑制器和細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器，在增殖和自噬中起重要作用。Atg13可以被肝激酶B1、鈣依賴性蛋白激酶β及一些小分子磷酸化和激活?；罨腁tg13與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遷移密切相關(guān)。因此，Atg13是一種正調(diào)節(jié)劑，可響應(yīng)能量消耗刺激自噬。最近的研究表明，Atg13通過磷酸化和激活ULK1直接調(diào)節(jié)自噬。本研究結(jié)果表明，激活肝癌HepG2細(xì)胞中的Atg13，可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。ULK1/Atg13復(fù)合物在ROS的調(diào)節(jié)和功能中起作用。ROS通過Atg13磷酸化自噬相關(guān)激酶ULK1來調(diào)節(jié)自噬。有證據(jù)表明ROS在自噬誘導(dǎo)中響應(yīng)各種細(xì)胞應(yīng)激(包括葡萄糖饑餓)的作用[23]。ULK1是腫瘤抑制因子和細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器，它在增殖和自噬中起重要作用，ULK1可被肝激酶B1，鈣依賴性蛋白激酶-β和一些小分子磷酸化和激活，活化的ULK1與癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)，侵襲和遷移密切相關(guān)[24-26]。因此，ULK1是一種正能調(diào)節(jié)因子，可以響應(yīng)能量消耗而刺激自噬。最近的研究表明，ULK1通過磷酸化和激活BAX直接調(diào)節(jié)自噬。本結(jié)果顯示，與肝癌HepG2細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表達(dá)水平、ROS水平升高。與上述討論一致，說明竹節(jié)香附素A可促進(jìn)ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表達(dá)及ROS表達(dá)，進(jìn)而激活 ULK1/Atg13及ROS通路進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬。

綜上所述，竹節(jié)香附素A能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬及凋亡；其機(jī)制與竹節(jié)香附素A可促進(jìn)ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表達(dá)及ROS表達(dá)，激活ULK1/Atg13及ROS通路有關(guān)。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

趙利：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；馬向明：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；王瑛：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；吉瑞更：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；付慶江、曹立瀛：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫