70%,若肝癌進(jìn)入"/>

亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        竹節(jié)香附素A通過ULK1/Atg13及ROS途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞自噬的作用研究

        2020-10-20 08:46:18趙利馬向明王瑛吉瑞更付慶江曹立瀛
        疑難病雜志 2020年10期
        關(guān)鍵詞:肝癌劑量水平

        趙利,馬向明,王瑛,吉瑞更,付慶江,曹立瀛

        肝癌在全球癌癥相關(guān)死亡中排名第二,早期肝癌患者及時(shí)診斷預(yù)后良好,5年生存率> 70%,若肝癌進(jìn)入晚期, 5年生存率<16%[1-3]。自噬是一種細(xì)胞內(nèi)降解途徑,是一種復(fù)雜的分解代謝過程,涉及長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)的循環(huán)和分解,以及細(xì)胞內(nèi)無用細(xì)胞器的降解。作為細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑,自噬與腫瘤細(xì)胞的存活相關(guān)[4-5]。越來越多的證據(jù)表明,在各種抗癌藥誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過程中,細(xì)胞凋亡和自噬之間存在復(fù)雜的功能關(guān)系。竹節(jié)香附素A具有抗炎、抗腫瘤和抗菌能力,其通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)治療作用[6-7]。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中,竹節(jié)香附素A誘導(dǎo)自噬,通過降低耐藥性來殺傷癌細(xì)胞?;钚匝?ROS)是自噬相關(guān)的上游細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)自噬激活激酶1 (ULK1)/自噬相關(guān)蛋白13(Atg13)過表達(dá)進(jìn)而激活自噬通路[8]。本研究擬探討竹節(jié)香附素A通過ULK1/Atg13及ROS途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞自噬的作用,為肝癌的治療提供理論依據(jù),報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù),批號(hào)18091603。(2)試藥試劑: L-谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;竹節(jié)香附素A購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;5氟尿嘧啶、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、吖啶橙染色試劑盒購(gòu)自美國(guó)sigma公司;HEPES緩沖液、裂解緩沖液、BCA蛋白法含量測(cè)試盒、5%牛血清白蛋白(BSA)、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)、TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自美國(guó)NEB公司;SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)自日本Takara公司;PVDF膜購(gòu)自北京明陽科華生物科技有限公司;ULK1、Atg13、β-actin一抗購(gòu)自安諾倫(北京)生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。(3)儀器:MK-9型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)伯樂公司;Olympus CKX31型熒光顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;XC-987型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司;QuantStudio5型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司;LAS3000型顯影儀購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

        1.2 肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 2019年8—9月于開灤總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。肝癌HepG2細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基, 在37℃、5%CO2的正常培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)。分組:肝癌HepG2細(xì)胞組、5-氟尿嘧啶組、竹節(jié)香附素A低劑量組、竹節(jié)香附素A高劑量組,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中干預(yù)組分別加入5氟尿嘧啶(濃度為80 mg/μl,預(yù)試驗(yàn)求出5氟尿嘧啶的LC50為160 μg/ml,以1/2 LC50為作用劑量)、不同劑量的竹節(jié)香附素A,竹節(jié)香附素A低、高劑量分別為100、200 mg/μl。以上各組每孔設(shè)6個(gè)平行樣,培養(yǎng)72 h。

        1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

        1.3.1 細(xì)胞增殖水平測(cè)定:將肝癌HepG2細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種到96孔板中,與無血清培養(yǎng)基孵育4 h,使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞存活率,在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(OD值)。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(對(duì)照組OD-空白組OD)×100%。

        1.3.2 細(xì)胞自噬檢測(cè):通過吖啶橙染色觀察自噬情況。將HepG2細(xì)胞(6×105個(gè)/孔)接種到18 mm×18 mm蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,并用磷酸緩沖液4 μl處理72 h,然后沖洗并用吖啶橙(10 mg/L)在37℃染色持續(xù)30 min,蓋上蓋玻片后,使用熒光顯微鏡觀察樣品,以評(píng)估從綠色到紅色的顏色變化。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)酸性自噬小體(紅色),說明細(xì)胞發(fā)生自噬,為陽性細(xì)胞;細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)綠色熒光,說明細(xì)胞未發(fā)生自噬,為陰性細(xì)胞。于高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞,并計(jì)數(shù)自噬小體個(gè)數(shù)。

        1.3.3 肝癌HepG2細(xì)胞凋亡檢測(cè):各組肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后,收獲細(xì)胞,磷酸鹽緩沖液洗滌1次并離心,使用膜聯(lián)蛋白V/PI雙染色的流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。將全細(xì)胞收集在HEPES緩沖液(pH 7.4的10 mmol/L HEPES,140 mmol/L NaCl和2.5 mmol/L CaCl2)中,隨后,用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(FITC)(2.5 μg/ml)和PI(2 ng/ml)染色細(xì)胞20 min,然后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行分析,使用Cell Quest軟件分析凋亡水平,早期凋亡(膜聯(lián)蛋白V+/PI-)和晚期凋亡(膜聯(lián)蛋白V+/PI+)的總和為總細(xì)胞凋亡。

        1.3.4 細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA水平測(cè)定: TRIzol試劑分離肝癌HepG2細(xì)胞總RNA,使用ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA,使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行定量PCR分析,制備20 μl反應(yīng)體系,在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng),將靶基因的表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列:ULK1正向5'-CGGTAGTTTGCCGTGAGTGA-3',反向5'-CCGTGACGCTCCCGTGGATG-3';Atg13正向5'-CCGTGTGATTGGCTTCCGCCGTGAC-3',反向5'-CCTGTGTGACTCCCTGCCGTGGAGT-3';β-actin正向5'-CCAGGAAAAGGTGTGAAATC-3',反向5'-AAGCGCTTGGTGGTCAGATT-3'。反應(yīng)條件:95℃ 15 s,95℃ 10 s,60℃ 5 s,72℃ 35 s,并擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。并使用2-△△Ct方法確定ULK1、Atg13 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

        1.3.5 細(xì)胞ULK1、Atg13蛋白水平測(cè)定:收集肝癌HepG2細(xì)胞,將所有細(xì)胞在冰上用裂解緩沖液裂解30 min,并將細(xì)胞碎片在4℃下離心,通過BCA蛋白法含量測(cè)試盒檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。使用二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)將蛋白質(zhì)在12V電壓下分離,而后將其印跡到PVDF膜上,在室溫下用5%脫脂干乳液在5%牛血清白蛋白封閉膜2 h。將PVDF膜與ULK1、Atg13、β-actin一抗(稀釋比1∶1 000)在4℃下孵育24 h,在BSA中洗滌PVDF膜3次,持續(xù)10 min,在37℃下將辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗(稀釋比1∶2 000)孵育1 h,在BSA中洗滌PVDF膜3次,持續(xù)10 min。使用化學(xué)發(fā)光ECL測(cè)定試劑盒檢測(cè)各蛋白質(zhì),使用LAS3000型顯影儀顯示W(wǎng)estern印跡,通過MultigaugeV3.0軟件應(yīng)用圖像分析檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)。

        1.3.6 ROS檢測(cè):ROS水平通過2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Beyotime)測(cè)量。讓96孔板上的肝癌HepG2細(xì)胞附著過夜,然后用相應(yīng)藥物處理24 h,除去培養(yǎng)基,用PBS洗滌3次,然后與DCFH-DA在37℃下溫育30 min,通過酶標(biāo)儀測(cè)量488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)的ROS水平。

        2 結(jié) 果

        2.1 各組肝癌HepG2細(xì)胞OD值、存活率比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞OD值、存活率降低(t/P=15.639/0.000、21.547/0.000、18.541/0.000、26.324/0.000、18.514/0.000、16.852/0.000);與5-氟尿嘧啶組比較,竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞OD值、存活率升高(t/P=21.214/0.000、19.547/0.000、18.547/0.000、25.478/0.000);與竹節(jié)香附素A低劑量組比較,竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞OD值、存活率降低(t/P=16.547/0.000、23.547/0.000),見表1。

        表1 各組肝癌HepG2細(xì)胞OD值、存活率比較

        2.2 各組肝癌HepG2細(xì)胞自噬小體水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組(63.54±12.54個(gè))比較,5-氟尿嘧啶組(598.54±15.64個(gè))、竹節(jié)香附素A低劑量組(290.47±17.54個(gè))、高劑量組(483.65±15.69個(gè))自噬小體數(shù)升高(t/P=10.547/0.000、16.547/0.000、20.547/0.000);與5-氟尿嘧啶組比較,竹節(jié)香附素A低、高劑量組自噬小體數(shù)降低(t/P=16.325/0.000、22.547/0.000);與竹節(jié)香附素A低劑量組比較,竹節(jié)香附素A高劑量組自噬小體數(shù)升高(t/P=15.696/0.000),見圖1。

        2.3 肝癌HepG2細(xì)胞凋亡率比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組細(xì)胞凋亡率(0.90±0.24)%比較,5-氟尿嘧啶組(10.80±0.26)%、竹節(jié)香附素A低劑量組(2.30±0.23)%、高劑量組(9.00±0.29)%升高(t/P=12.321/0.000、25.547/0.000、19.541/0.000);與5-氟尿嘧啶組比較,竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞凋亡率降低(t/P=9.874/0.000、16.589/0.000);與竹節(jié)香附素A低劑量組比較,竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞凋亡率升高(t/P=10.654/0.000),見圖2。

        2.4 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平升高(t/P=25.654/0.000、15.987/0.000、23.547/0.000、18.654/0.000、18.547/0.000、16.547/0.000);與5-氟尿嘧啶組比較,竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平降低(t/P=13.654/0.000、14.654/0.000、16.589/0.000、21.247/0.000);與竹節(jié)香附素A低劑量組比較,竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平升高(t/P=14.697/0.000、18.324/0.000),見表2。

        表2 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13 mRNA表達(dá)水平比較

        2.5 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13蛋白表達(dá)水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13蛋白表達(dá)水平升高(t/P=18.741/0.000、16.547/0.000、17.548/0.000、16.547/0.000、15.847/0.000、20.478/

        0.000);與5-氟尿嘧啶組比較,竹節(jié)香附素A低、高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 蛋白表達(dá)水平降低(t/P=21.687/0.000、18.324/0.000、18.541/0.000、19.587/0.000);與竹節(jié)香附素A低劑量組比較,竹節(jié)香附素A高劑量組細(xì)胞ULK1、Atg13 蛋白表達(dá)水平升高(t/P=17.024/0.000、19.634/0.000),見表3、圖3。

        表3 各組肝癌HepG2細(xì)胞ULK1、Atg13 蛋白表達(dá)水平比較分)

        注:A.肝癌HepG2細(xì)胞組;B.5-氟尿嘧啶組;C.竹節(jié)香附素A低劑量組;D.竹節(jié)香附素A高劑量組

        肝癌HepG2細(xì)胞組 5-氟尿嘧啶組 竹節(jié)香附素A低劑量組 竹節(jié)香附素A高劑量組

        肝癌HepG2細(xì)胞組 5-氟尿嘧啶組 竹節(jié)香附素A低劑量組 竹節(jié)香附素A高劑量組

        2.6 各組肝癌HepG2細(xì)胞ROS水平比較 與肝癌HepG2細(xì)胞組ROS水平(51.08±1.13)mol/ml比較,5-氟尿嘧啶組(59.89±1.23)mol/ml、竹節(jié)香附素A低劑量組(54.14±1.27)mol/ml、高劑量組(56.56±1.36)mol/ml升高(t/P=13.254/0.000、18.524/0.000、16.254/0.000);與5-氟尿嘧啶組比較,竹節(jié)香附素A低、高劑量組ROS水平降低(t/P=19.654/0.000、24.052/0.000);與竹節(jié)香附素A低劑量組比較,竹節(jié)香附素A高劑量組ROS水平升高(t/P=18.547/0.000)。

        3 討 論

        竹節(jié)香附素A具有多種生物活性,包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤活性。研究表明,竹節(jié)香附素A是Bcl-2蛋白表達(dá)的有效抑制劑,是各種腫瘤中抗凋亡蛋白的抑制劑[9]。竹節(jié)香附素A在多種癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在人類肺癌細(xì)胞中,竹節(jié)香附素A可以抑制癌細(xì)胞遷移和入侵。竹節(jié)香附素A還可抑制炎性因子核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1),而腫瘤血管生成與炎性反應(yīng)密切相關(guān);竹節(jié)香附素A也可抑制腫瘤血管生成[10]。這些結(jié)果表明,竹節(jié)香附素A可能具有抗腫瘤治療的潛力。本研究發(fā)現(xiàn),與肝癌HepG2細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組OD值、存活率降低,細(xì)胞自噬小體、凋亡率水平升高。這提示竹節(jié)香附素A能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬及凋亡。細(xì)胞凋亡和自噬是程序性細(xì)胞死亡的2種重要類型。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是殺死腫瘤細(xì)胞的主要分子機(jī)制,其有2種信號(hào)通路,包括外源和內(nèi)源通路[11-14]。內(nèi)在凋亡途徑,也稱為線粒體啟動(dòng)途徑,與細(xì)胞色素C(Cyto-C)釋放到細(xì)胞質(zhì)有關(guān),后者激活下游含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase),包括Atg13,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究已發(fā)現(xiàn)[15],在胃癌細(xì)胞中,竹節(jié)香附素A通過激活Caspase信號(hào)通路誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,這與本研究結(jié)果一致。

        自噬是將細(xì)胞質(zhì)材料遞送至溶酶體以降解的過程。超過30個(gè)基因參與自噬,其稱為Atg。Atg13是雷帕霉素(TOR)激酶信號(hào)通路的靶點(diǎn),通過Atg13和ULK1的磷酸化及ULK1/Atg13復(fù)合物的調(diào)節(jié)來影響自噬[16-19]。此外,近年來越來越多的證據(jù)表明,ULK1具有抗增殖活性。當(dāng)ULK1用作腫瘤抑制因子表達(dá)時(shí),它主要定位于細(xì)胞質(zhì);當(dāng)ULK1抑制上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化時(shí),它會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核中[20]。數(shù)據(jù)表明,ULK1通過抑制增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)蛋白來抑制食管組織細(xì)胞核中的增殖。此外,ULK1通過p53依賴性途徑在腎上皮細(xì)胞(HEK293)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(HepG2)和人乳腺癌(MDA-MB-231、MCF-73)中顯示出顯著的抗增殖作用[21-22]。在體外細(xì)胞研究中,CCK-8和細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)表明,過表達(dá)ULK1可以有效抑制A549和H1299肺癌細(xì)胞的增殖。Atg13是腫瘤抑制器和細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器,在增殖和自噬中起重要作用。Atg13可以被肝激酶B1、鈣依賴性蛋白激酶β及一些小分子磷酸化和激活?;罨腁tg13與腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和遷移密切相關(guān)。因此,Atg13是一種正調(diào)節(jié)劑,可響應(yīng)能量消耗刺激自噬。最近的研究表明,Atg13通過磷酸化和激活ULK1直接調(diào)節(jié)自噬。本研究結(jié)果表明,激活肝癌HepG2細(xì)胞中的Atg13,可抑制肝癌細(xì)胞的增殖。ULK1/Atg13復(fù)合物在ROS的調(diào)節(jié)和功能中起作用。ROS通過Atg13磷酸化自噬相關(guān)激酶ULK1來調(diào)節(jié)自噬。有證據(jù)表明ROS在自噬誘導(dǎo)中響應(yīng)各種細(xì)胞應(yīng)激(包括葡萄糖饑餓)的作用[23]。ULK1是腫瘤抑制因子和細(xì)胞能量狀態(tài)的傳感器,它在增殖和自噬中起重要作用,ULK1可被肝激酶B1,鈣依賴性蛋白激酶-β和一些小分子磷酸化和激活,活化的ULK1與癌細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng),侵襲和遷移密切相關(guān)[24-26]。因此,ULK1是一種正能調(diào)節(jié)因子,可以響應(yīng)能量消耗而刺激自噬。最近的研究表明,ULK1通過磷酸化和激活BAX直接調(diào)節(jié)自噬。本結(jié)果顯示,與肝癌HepG2細(xì)胞組比較,5-氟尿嘧啶組及竹節(jié)香附素A低、高劑量組ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表達(dá)水平、ROS水平升高。與上述討論一致,說明竹節(jié)香附素A可促進(jìn)ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表達(dá)及ROS表達(dá),進(jìn)而激活 ULK1/Atg13及ROS通路進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬。

        綜上所述,竹節(jié)香附素A能明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)肝癌細(xì)胞自噬及凋亡;其機(jī)制與竹節(jié)香附素A可促進(jìn)ULK1、Atg13 mRNA和蛋白表達(dá)及ROS表達(dá),激活ULK1/Atg13及ROS通路有關(guān)。

        利益沖突:所有作者聲明無利益沖突

        作者貢獻(xiàn)聲明

        趙利:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;馬向明:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文審核;王瑛:實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;吉瑞更:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;付慶江、曹立瀛:課題設(shè)計(jì),論文撰寫

        猜你喜歡
        肝癌劑量水平
        課堂內(nèi)外·初中版(科學(xué)少年)(2023年10期)2023-12-10 00:43:06
        ·更正·
        張水平作品
        90Sr-90Y敷貼治療的EBT3膠片劑量驗(yàn)證方法
        LCMT1在肝癌中的表達(dá)和預(yù)后的意義
        加強(qiáng)上下聯(lián)動(dòng) 提升人大履職水平
        microRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展及診治中的作用
        Rab27A和Rab27B在4種不同人肝癌細(xì)胞株中的表達(dá)
        microRNA在肝癌診斷、治療和預(yù)后中的作用研究進(jìn)展
        高劑量型流感疫苗IIV3-HD對(duì)老年人防護(hù)作用優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)劑量型
        亚洲中文字幕无码不卡电影| 亚洲精品国产av一区二区| 美女丝袜诱惑在线播放蜜桃| 波多野结衣中文字幕一区二区三区 | 久久久久亚洲av成人人电影| 色欲人妻综合aaaaa网| 好大好硬好爽免费视频| 亚洲成年网站在线777| 日本在线一区二区三区观看| 开心五月天第四色婷婷| 精品少妇爆乳无码av无码专区| 亚洲熟女网站| 在线无码免费看黄网站| 最新亚洲视频一区二区| 日本亚洲中文字幕一区| 国产综合在线观看| 99热精品成人免费观看| 国产成人永久在线播放| 经典黄色一区二区三区| 麻豆免费观看高清完整视频| 国产真人无遮挡作爱免费视频| 美女叉开双腿让男人插| 国产精品麻豆一区二区三区| 少妇爆乳无码专区| 国内少妇偷人精品视频免费| 精品午夜一区二区三区| 91精品国产综合久久熟女| 怡红院a∨人人爰人人爽| 亚洲熟妇大图综合色区| 情av一区二区三区在线观看| 成人欧美一区二区三区黑人| 国产va免费精品高清在线| 国产一精品一aⅴ一免费| 粉嫩的极品女神尤物在线| 粗大猛烈进出白浆视频| 丰满爆乳一区二区三区| 久久精品国产成人午夜福利| 白白发在线视频免费观看2| 国产涩涩视频在线观看| 欧美日本国产亚洲网站免费一区二区 | 999国内精品永久免费观看|