董文亮,劉洪濤,初侃,侯鐵偉,肖遙
原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一,位于世界惡性腫瘤發(fā)病率的第6位,致死率第2位,以乙肝細胞癌或丙肝細胞癌最為常見,約占80%[1-2]。據(jù)研究統(tǒng)計,我國原發(fā)性肝癌患者術(shù)后5年生存率約10%[3]。因此研究原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的分子標志物,為原發(fā)性肝癌及時診斷、治療和預(yù)后提供依據(jù)迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn),泛素偶聯(lián)酶E2C(UBE2C)過表達能夠抑制細胞有絲分裂紡錘體檢查點,破壞其監(jiān)測功能,從而促進腫瘤細胞增殖、侵襲[4-5]。近幾年研究表明,UBE2C在乳腺癌、胃癌、食管鱗癌組織中高表達[6-8],而在原發(fā)性肝癌中表達水平及與預(yù)后關(guān)系未見國內(nèi)外相關(guān)報道。因此,現(xiàn)分析原發(fā)性肝癌組織UBE2C表達水平與患者臨床病理參數(shù)及術(shù)后預(yù)后的關(guān)系,報道如下。
1.1 臨床資料 選取2014年1月—2016年12月北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普外科手術(shù)治療原發(fā)性肝癌患者109例(肝癌組),術(shù)中留取原發(fā)性肝癌組織3 mm3,同時取距原發(fā)性肝癌組織5 cm處同體積正常肝臟組織為癌旁組?;颊咧心?9例,女50例,年齡39~75(55.24±6.49)歲;病程3~15(8.24±2.93)個月;嗜酒31例(28.44%);肝炎病毒感染89例(81.65%);TNM分期:Ⅰ~Ⅱ期40例,Ⅲ~Ⅳ期69例;分化程度:高中分化39例,低分化70例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例;有淋巴結(jié)血管間隙浸潤54例,無浸潤55例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準通過,患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。
1.2 選擇標準 (1)納入標準:①所有患者經(jīng)病理診斷確診為原發(fā)性肝癌[9];②患者臨床資料完整、詳細,能夠接受術(shù)后隨訪;③無既往治療史和家族遺傳史。(2)排除標準:①腎功能異?;颊?;②并發(fā)其他惡性腫瘤患者;③伴有心臟病、糖尿病患者;④合并其他原因引起的肝硬化、肝腺瘤等。
1.3 觀測指標與方法
1.3.1 UBE2C表達檢測:采用免疫組化法測定UBE2C在原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織中表達水平。病理標本均由同一病理科醫(yī)生獨立完成。使用輪轉(zhuǎn)式切片機(RM2016型,德國徠卡公司)常規(guī)制作原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織石蠟切片(厚度約4 mm),常溫下用3% H2O2阻斷切片中過氧化氫酶活性,修復(fù)抗原,PBS清洗3次,加入UBE2C單克隆抗體(武漢維克賽思科技有限公司),置于4℃冰箱中過夜,加入二抗(北京百奧萊博科技有限公司),25℃孵育30 min,隨后加入鏈霉親和素—過氧化物酶室溫孵育15 min,PBS清洗3次,用DAB顯色,最后用蘇木素復(fù)染,60%、80%、90%、100%乙醇梯度洗脫脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,SPCC-200型生物顯微鏡(購自東莞市譜標實驗器材科技有限公司)觀察,用試劑盒提供的陽性病理切片作為陽性對照,PBS代替一抗作為空白對照。
1.3.2 隨訪情況:對所有患者進行3年隨訪,隨訪截止時間為2019年12月31日,死亡患者以死亡日期作為隨訪截止時間,隨訪方式為入戶、電話隨訪,隨訪內(nèi)容為患者生存情況、病情變化等。
1.4 結(jié)果判定 免疫組化結(jié)果采用半定量法進行判定,即通過所取切片的陽性染色深度和陽性細胞所占百分比來共同決定。實驗結(jié)果分別由3位專業(yè)實驗人員獨立判斷評定,根據(jù)評分標準描述UBE2C表達水平。判斷標準[10]:UBE2C陽性表達為細胞核中出現(xiàn)棕色至棕褐色顆粒,大部分均勻分布在胞核或位于核膜下方,部分呈小斑塊不規(guī)則分布。陽性染色強度評分:樣品無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。在顯微鏡下,隨機選取10個高倍視野(×400),記錄細胞數(shù),按照陽性染色細胞所占百分比評分。評分標準:陽性染色細胞所占比例<5%為0分,5%~25%為1分,26%~50%為2分,>50%為3分。將染色強度評分與陽性染色細胞所占百分比的評分相乘,根據(jù)二者乘積大小將免疫組化結(jié)果進行等級劃分:0~1分記為陰性(-),2~3分記為弱陽性(+),4~6分記為陽性(++),7~9分記為強陽性(+++)。其中陰性和弱陽性記為UBE2C低表達,陽性和強陽性記為UBE2C高表達。
2.1 2組UBE2C表達水平比較 免疫組化檢測結(jié)果表明,原發(fā)性肝癌組織中UBE2C陽性表達率為92.66%(101/109),顯著高于癌旁組織的64.22%(70/109),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.067,P=0.000),見表1。
表1 原發(fā)性肝癌組織及癌旁組織中UBE2C表達水平比較 [例(%)]
2.2 UBE2C表達水平在不同原發(fā)性肝癌臨床病理參數(shù)中比較 原發(fā)性肝癌組織中UBE2C的表達水平在患者的不同性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而在不同TNM分期、淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)中比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2。
2.3 UBE2C表達水平與原發(fā)性肝癌臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析 UBE2C表達水平與TNM分期、淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)呈正相關(guān)(r/P=0.506/0.000、0.517/0.000、0.493/0.002)。
2.4 不同UBE2C表達水平原發(fā)性肝癌患者生存率比較 UBE2C高表達原發(fā)性肝癌患者中位生存時間為23.32個月,顯著短于UBE2C低表達患者的33.32個月(χ2=9.129,P=0.003), 見圖1。
圖1 不同UBE2C表達水平原發(fā)性肝癌患者生存率比較
2.5 影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的危險因素分析 多因素分析結(jié)果表明,有淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)及UBE2C高表達的原發(fā)性肝癌患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險明顯高于無淋巴血管間隙浸潤、未復(fù)發(fā)及UBE2C低表達的患者(OR=2.880、2.975、3.475,P均<0.05), 見表3。
表2 UBE2C表達水平與原發(fā)性肝癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [例(%)]
表3 影響原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的危險因素分析
全世界每年新增原發(fā)性肝癌患者約900萬,其中我國約400萬,嚴重威脅人民的身體健康[11]。原發(fā)性肝癌患者臨床表現(xiàn)為肝部刺痛或持續(xù)性鈍痛,并伴隨腹脹,目前臨床上對原發(fā)性肝癌主要采用以手術(shù)為主,化療、放療、分子靶向治療為輔的策略[12]。原發(fā)性肝癌早期臨床表現(xiàn)不明顯,導(dǎo)致難以及時發(fā)現(xiàn)、治療,因而大多數(shù)患者確診時已處于中晚期,術(shù)后預(yù)后差[13-14],因此臨床上急需探尋一種分子標志物用于原發(fā)性肝癌患者預(yù)后判斷及靶向治療,以改善原發(fā)性肝癌患者不良預(yù)后,提高生存率。
UBE2C類屬于人泛素偶聯(lián)酶家族,通過對細胞質(zhì)、細胞膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核等處蛋白質(zhì)進行蛋白酶體和泛素化酶調(diào)控發(fā)揮作用[15-16]。UBE2C能夠參與細胞有絲分裂和周期蛋白相關(guān)因子的泛素化進程,從而發(fā)揮促進細胞有絲分裂的功能,其高表達可誘導(dǎo)胞內(nèi)功能蛋白質(zhì)降解,破壞細胞染色體組結(jié)構(gòu),在腫瘤組織中的異常表達逐漸引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注。本研究發(fā)現(xiàn),原發(fā)性肝癌組織中UBE2C陽性表達率顯著高于癌旁組織,表明UBE2C水平上調(diào)可能與原發(fā)性肝癌發(fā)生有關(guān)。Nicolau-Neto等[17]研究發(fā)現(xiàn),食管鱗狀細胞癌組織中UBE2C過表達,瘤旁組織中低表達,UBE2C可能通過調(diào)控細胞周期蛋白B1水平,影響食管鱗癌細胞增殖和周期,有望成為腫瘤生物標志物候選物。本研究提示,UBE2C也可能通過調(diào)控B1等相關(guān)蛋白表達影響染色體結(jié)構(gòu)和肝癌細胞周期,進而促進肝癌細胞增殖等,影響肝癌發(fā)生。馮力[18]研究表明,UBE2C在神經(jīng)母細胞瘤組織中陽性表達率顯著升高,且與神經(jīng)母細胞瘤分期、復(fù)發(fā)相關(guān),提示UBE2C可能在神經(jīng)母細胞瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)進程中發(fā)揮作用[18]。本研究結(jié)果顯示,UBE2C在原發(fā)性肝癌組織中的表達水平與患者TNM分期、淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)呈正相關(guān),與上述研究結(jié)果相似,提示原發(fā)性肝癌組織中UBE2C高表達還可能預(yù)示肝癌分期升高、轉(zhuǎn)移發(fā)生及患者復(fù)發(fā)風(fēng)險增加,該過程可能與UBE2C水平升高引起癌細胞周期異常改變有關(guān)。
TCGA數(shù)據(jù)庫分析表明,UBE2C在腎透明細胞癌組織中表達水平顯著升高,與患者生存期有關(guān)[19]。翁鴻等[20]研究發(fā)現(xiàn),膀胱癌變組織中UBE2C基因高表達組患者的預(yù)后差于低表達組,提示UBE2C高表達與膀胱癌患者不良預(yù)后有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),UBE2C高表達原發(fā)性肝癌患者中位生存時間顯著短于低表達患者,與上述研究結(jié)果一致,提示UBE2C高表達可能與原發(fā)性肝癌患者生存時間短等不良預(yù)后發(fā)生有關(guān),UBE2C可能成為評價原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的臨床指標。本研究還通過COX多因素回歸分析發(fā)現(xiàn),有淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)及UBE2C高表達的原發(fā)性肝癌患者發(fā)生不良預(yù)后的風(fēng)險明顯高于無淋巴血管間隙浸潤、未復(fù)發(fā)及UBE2C低表達患者,進一步提示UBE2C水平升高可能預(yù)示原發(fā)性肝癌患者不良預(yù)后風(fēng)險增加,應(yīng)對UBE2C高表達患者定期檢查,以及時發(fā)現(xiàn)、治療,減少不良預(yù)后發(fā)生。
綜上所述,UBE2C在原發(fā)性肝癌組織中陽性表達率顯著升高,與原發(fā)性肝癌患者TNM分期、淋巴血管間隙浸潤、復(fù)發(fā)及生存情況相關(guān),有望成為原發(fā)性肝癌預(yù)后的檢測指標,但是UBE2C參與原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的機制有待進一步探究。
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻聲明
董文亮:設(shè)計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;劉洪濤:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;初侃:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;侯鐵偉:進行統(tǒng)計學(xué)分析;肖遙:課題設(shè)計,論文撰寫