黃超群，劉微，高文娟，段體龍，王丹丹

肝細(xì)胞癌為惡性腫瘤，對患者的生活質(zhì)量和生命安全造成了嚴(yán)重威脅[1-2]。臨床上對肝癌的發(fā)病原因尚未完全清楚，但眾多學(xué)者一致認(rèn)為其是受多種因素影響的復(fù)雜過程[3-4]。肝癌發(fā)生早期并沒有明顯的癥狀，當(dāng)被發(fā)現(xiàn)時，肝癌已屬晚期，耽誤了疾病的最佳治療時機(jī)，嚴(yán)重威脅患者的生命安全[5-6]。臨床上將上皮組織和間葉組織起源的肝癌稱為原發(fā)性肝癌，其在我國具有高發(fā)性和高危險性[7-8]。現(xiàn)探究HBx-MALAT-XB130通路對肝癌細(xì)胞生長和遷移的影響機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)人肝癌細(xì)胞株:購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。(2)藥物、試劑：MTT試劑盒(艾美捷科技有限公司)；PBS緩沖液、SSC溶液、多聚甲醛(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，DAPI染色劑(北京富百科生物技術(shù)有限公司)。(3)儀器設(shè)備：Transwell小室(上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；離心機(jī)(杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號TG16-WS)、酶標(biāo)儀(濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司，型號F50)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2019年6—10月于解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第962醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)獲醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2.1 人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)：于40℃時對凍存的肝癌細(xì)胞進(jìn)行火浴處理，之后充分搖晃，將混合均勻的肝癌細(xì)胞置于培養(yǎng)基[10%PBS、1%雙抗(青鏈霉素)RPMI-1640培養(yǎng)基]2 ml中，之后離心處理，進(jìn)行重懸處理后將細(xì)胞傳代，使用CO2培養(yǎng)箱對培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、換液，細(xì)胞融合率達(dá)90%后傳代。

1.2.2 慢病毒載體構(gòu)建：引物序列根據(jù)質(zhì)粒特點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引入SacⅠ酶切位點(diǎn)(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)。正反鏈混合后加入退火緩沖液，96℃反應(yīng)4 min，室溫冷卻，生成雙鏈。使用Eco31Ⅰ酶切線性化質(zhì)粒pGenesil-1，100倍稀釋退火產(chǎn)物之后與其連接，20℃下水浴孵育過夜，使用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，第2天選擇單克隆菌落，在Kana的LB培養(yǎng)液(30 μg/ml)中接種，離心處理，37℃下震蕩混勻，孵育過夜。少量抽提質(zhì)粒后使用SacⅠ酶切進(jìn)行鑒定[由寶生物工程(大連)有限公司完成]，分為低阻斷組、中阻斷組、高阻斷組。重懸處理后分別加入DAPT 1 ml、5 ml、10 ml中，電擊處理后室溫下存放120 min，將各組細(xì)胞加入6孔、96孔培養(yǎng)板中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，取出后加入含G418的培養(yǎng)基800 μg/ml中再次培養(yǎng)。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 MTT法檢測細(xì)胞生長能力：將各組細(xì)胞加入96孔板中，分別于12、24、48、72 h后在每孔中加入MTT液30 μl，37℃孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl ，酶標(biāo)儀在498 nm波長處檢測每孔的OD值，檢測肝癌細(xì)胞生長情況。

1.3.2 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡：常溫下使用蛋白酶K 20 μg/ml培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白，使用PBS緩沖液進(jìn)行徹底清洗，加入平衡緩沖液100 μl，室溫環(huán)境中平衡10 min，然后滴入TdT酶反應(yīng)液100 μl，避光、室溫下孵育1 h，之后加入 SSC溶液100 μl，常溫下靜置20 min后進(jìn)行清洗3次，使用DAPI進(jìn)行復(fù)染，避光培養(yǎng)10 min后再次進(jìn)行浸洗，封片觀察。DAPI復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色，凋亡細(xì)胞核呈綠色，每張切片取3個視野進(jìn)行觀察，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，取其平均值。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期：將各組細(xì)胞傳代至5孔板，并將其置于5% CO2、37℃下培養(yǎng)，添加0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，離心處理10 min，使用PBS緩沖液進(jìn)行清洗，再次離心處理，之后添加PI染液1 ml，置于常溫、避光環(huán)境60 min，進(jìn)行特異熒光標(biāo)記后按照流式細(xì)胞儀操作方法檢測細(xì)胞周期分布。

1.3.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲：檢測前2 h濕化小室，上室加入細(xì)胞懸液200 μl ，在下室加入含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用PBS沖洗2次后置于4%多聚甲醛中30 min。染色后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移：使用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于6孔板。使用10槍尖垂直于孔板底部畫直線，PBS緩沖液清洗3次。常溫培養(yǎng)24 h拍照計(jì)算劃痕。

1.3.6 Western-blot法檢測Bcl-2、Bax、Caspase3、p53表達(dá)：使用PBS緩沖液對標(biāo)本沖洗之后裂解30 min，測定蛋白濃度。取20 μg/孔蛋白質(zhì)，添加蛋白緩沖液后進(jìn)行電泳，10 min后將電轉(zhuǎn)膜置于10%牛奶中浸泡，常溫環(huán)境下封閉90 min。之后結(jié)合一抗、稀釋，孵育1 d，取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合二抗，60 min后清洗、顯色，對Bcl-2、Bax、Caspase3、p53相對表達(dá)量進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 各組不同時間點(diǎn)肝癌細(xì)胞生長率比較 在24 h、48 h、72 h時進(jìn)行肝癌細(xì)胞生長率比較，低阻斷組<中阻斷組<高阻斷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

表1 3組不同時間點(diǎn)肝癌細(xì)胞生長率比較

2.2 各組不同時間點(diǎn)肝癌細(xì)胞凋亡率比較 在24 h、48 h、72 h時進(jìn)行肝癌細(xì)胞凋亡率比較，低阻斷組>中阻斷組>高阻斷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3 各組肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力比較 肝癌細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)比較，低阻斷組<中阻斷組<高阻斷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表3、圖1～2。

表2 3組不同時間點(diǎn)肝癌細(xì)胞凋亡率比較

表3 3組肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力比較個)

2.4 各組肝癌細(xì)胞周期分布比較 G1、S、G2期肝癌細(xì)胞比例比較，低阻斷組<中阻斷組<高阻斷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)，見表4。

表4 3組肝癌細(xì)胞周期分布比較

圖1 3組肝癌細(xì)胞侵襲情況(結(jié)晶紫染色，×100)

圖2 3組肝癌細(xì)胞遷移情況(Giemsa 染色，×100)

2.5 各組Bcl-2、Bax、Caspase3、p53相對表達(dá)量比較 Bcl-2相對表達(dá)量比較，低阻斷組>中阻斷組>高阻斷組， Bax、Caspase3、p53相對表達(dá)量比較，低阻斷組<中阻斷組<高阻斷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表5。

表5 3組Bcl-2、Bax、Caspase3、p53相對量表達(dá)比較

3 討 論

由于臨床上對肝癌的發(fā)病機(jī)制尚未研究透徹，所以有越來越多的學(xué)者投入到對肝癌的研究之中[9-10]。由于肝癌早期并沒有明顯的臨床癥狀，導(dǎo)致許多患者不能得到有效的早期治療，耽誤了最佳的治療時機(jī)[11-12]。肝癌發(fā)展的過程通常伴隨著各種臨床癥狀和危害，其臨床癥狀主要有肝區(qū)疼痛、乏力、納差等，也會經(jīng)常伴隨上消化道出血、肝衰竭、腎衰竭等，當(dāng)肝癌發(fā)展嚴(yán)重時，會造成患者死亡。肝癌患者的生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，對患者家庭和社會造成一定的影響[13-14]。HBx作為乙肝病毒X基因，是HBV基因組的一員，HBx-MALAT-XB130通路的作用在學(xué)術(shù)界得到了一致的認(rèn)可，在肝癌的表達(dá)中起到了重要的作用[15-16]。

肝癌組織中的細(xì)胞生長變化與肝癌的發(fā)生和發(fā)展具有密切的聯(lián)系[17-18]。有學(xué)者研究表明，對肝癌細(xì)胞的生長率進(jìn)行調(diào)控，能夠起到抑制肝癌細(xì)胞發(fā)展的作用。本研究結(jié)果顯示，阻斷HBx-MALAT-XB130通路導(dǎo)致肝癌細(xì)胞生長率出現(xiàn)明顯上升，說明HBx-MALAT-XB130通路與肝癌細(xì)胞的生長關(guān)系密切，調(diào)控該通路能夠影響肝癌細(xì)胞生長情況，為肝癌的臨床治療起到一定的參考作用。

肝癌的發(fā)生和發(fā)展與肝癌細(xì)胞的凋亡具有密切聯(lián)系[19-20]。XB130和HBx的共同表達(dá)能夠?qū)?0Co-γ射線所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行抵抗，并且其共同表達(dá)能夠?qū)?xì)胞周期起到阻滯作用。本研究結(jié)果顯示，阻斷HBx-MALAT-XB130通路導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡能力下降，說明HBx-MALAT-XB130通路表達(dá)與肝癌細(xì)胞凋亡能力具有密切聯(lián)系，調(diào)控該通路能夠影響癌細(xì)胞凋亡能力，從而干預(yù)癌細(xì)胞的生長。

大量臨床研究資料表明，肝癌的發(fā)展與癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力具有密切聯(lián)系。對細(xì)胞的侵襲和遷移能力進(jìn)行抑制，能夠抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)展。有學(xué)者在研究中表明，對胃癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力進(jìn)行抑制，能夠?qū)ξ赴┻M(jìn)行調(diào)控[21]。本研究對肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)阻斷HBx-MALAT-XB130通路導(dǎo)致肝癌細(xì)胞侵襲、遷移能力上升，說明HBx-MALAT-XB130通路與癌細(xì)胞侵襲、遷移密切相關(guān)，調(diào)控該通路能夠影響癌細(xì)胞侵襲、遷移能力，從而起到抑制肝癌細(xì)胞發(fā)展、擴(kuò)散的作用。

細(xì)胞周期作為一個連續(xù)不斷的過程，是機(jī)體細(xì)胞活動的基礎(chǔ)生物學(xué)行為，與細(xì)胞增殖和凋亡能力有著密切的聯(lián)系。細(xì)胞分期可分為合成前期、合成期、合成后期3個時期，分別以G1、S、G2來表示。研究表明，在合成前期對癌細(xì)胞進(jìn)行阻滯，能夠?qū)ζ涞蛲瞿芰M(jìn)行調(diào)控[22]。本研究對肝癌細(xì)胞中細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)阻斷HBx-MALAT-XB130通路導(dǎo)致肝癌細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞比例出現(xiàn)上升，從而影響細(xì)胞凋亡能力，說明HBx-MALAT-XB130通路與肝癌細(xì)胞周期分布具有密切聯(lián)系，調(diào)控該通路能夠?qū)Ω伟┘?xì)胞周期分布起到阻滯作用。

綜上所述，HBx-MALAT-XB130通路與肝癌細(xì)胞生長、凋亡、侵襲、遷移及肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期分布情況有密切的聯(lián)系，能夠?yàn)楦伟┑呐R床治療起到一定的參考作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

黃超群：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫；劉微：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；高文娟：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；段體龍：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；王丹丹：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫