劉嬌，劉青，王大明，賈興旺，陶淑慧，徐建國

慢性乙型肝炎(CHB)是一種常見傳染性疾病，全球約2.4億人攜帶乙型肝炎病毒(HBV)，嚴重威脅人類健康，我國是該病高發(fā)區(qū)，約占40%[1]。HBV是一種沒有明顯細胞毒性的嗜肝性雙鏈DNA病毒，其生物活性及復制水平受各種因素影響，HBV感染可導致急性或慢性肝炎，是引起肝纖維化、肝硬化、肝癌的主要因素之一，因此尋找影響乙型肝炎病毒-DNA(HBV-DNA)復制的生物因子有重要意義[2]。研究報道，微小RNA(miRNA)對肝損傷十分敏感，miR-122、miR-146a均是免疫相關性miRNA，可參與細胞免疫應答及炎性反應，miR-122可預測干擾素治療CHB的療效，且與HBV-DNA高載量CHB患者肝損傷及預后有關，miR-146a 與肝癌、肝損傷等肝臟疾病密切相關，但目前關于miR-122、miR-146a表達與HBV復制的關系鮮有報道[3-7]。外泌體是一類直徑為30～150 nm的小囊泡，研究報道血清外泌體中含有大量HBV-DNA及miRNA等成分，是HBV的一種重要傳播介質[8-9]。因此本研究擬通過檢測CHB患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達水平，分析其與HBV-DNA載量的關系，以期為臨床CHB的靶向治療提供參考，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年5月—2019年12月南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院肝病中心收治CHB患者285例，根據血清外泌體HBV-DNA載量分為3組，每組95例。低載量組(HBV-DNA<1×105拷貝/ml)男65例，女30例，年齡18～75(49.62±12.59)歲；病程(5.48±1.12)年；有HBV家族史33例；合并癥：糖尿病16例，高血壓12例。中載量組(1×105拷貝/ml ≤HBV-DNA≤1×107拷貝/ml)男66例，女29例，年齡19～76(50.14±12.97)歲；病程(5.75±1.21)年；有HBV家族史35例；合并癥：糖尿病14例，高血壓13例。高載量組(HBV-DNA>1×107拷貝/ml)男 67例，女28例，年齡18～75(51.32±12.86)歲；病程(6.73±1.36)年；有HBV家族史34例；合并癥：糖尿病15例，高血壓14例 。另取同期門診健康體檢者95例為健康對照組，男63例，女32例，年齡18～76(50.95±12.84)歲。4組受試者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準通過，受試者及其家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合“慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)”[10]中關于CHB的診斷標準；②血清樣本采集前患者未接受任何治療；③臨床檢測資料完整。(2)排除標準：①合并肝癌或其他腫瘤者；②妊娠或哺乳期婦女；③合并脂肪肝或其他類型肝炎病毒感染者；④心、肺、腎等臟器功能異?；驀乐夭∽冋?。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 血清外泌體檢測：(1)外泌體制備，CHB患者于入院次日、體檢者于體檢當日上午(8：00～10:00)采集空腹外周靜脈血10 ml， 離心收集血清，采用血清外泌體提取試劑盒(購自上海歌凡生物科技有限公司)提取血清外泌體，具體步驟嚴格按照說明書進行。提取物中外泌體采用透射電鏡(型號Glacios Cryo，購自美國Thermo公司)觀察鑒定。(2)血清外泌體HBV-DNA載量檢測，采用實時定量PCR(RT-qPCR)檢測血清外泌體HBV-DNA載量。(3)血清外泌體miR-122、miR-146a水平檢測，采取受試者外泌體50 μl，以RNA提取試劑盒(購自上海碧云天有限公司)提取外泌體總RNA，反轉錄得cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆?反轉錄試劑盒購自日本TaKaRa公司)。采用RT-qPCR儀(型號7500，購自美國Bio-Rad公司)對miR-122、miR-146a進行擴增。反應體系共25 μl：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)12.5 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1μl，ddH2O 8.5 μl(PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司)。反應條件為：95℃、5 s，95℃、30s，60℃、30s，72℃、15s，40個循環(huán)；添加溶解曲線。引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成，miR-122上游引物序列為：5′-CCCGTGATGCTTCTTTTCTC-3′，下游引物序列為：5′-ATGTGAGAGGCAGGGTTC AG-3′；miR-146a上游引物序列為：5′-CATGGGTTGTCTCAGTGTCAGAGC T-3′，下游引物序列為：5′-TGCCTTCTGTCTCCAGTCTTCCAA-3′；內參U6上游引物序列為：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-△△CT法對血清外泌體miR-122、miR-146a相對表達水平進行定量分析。

1.3.2 血清肝纖維化指標檢測：上述血清采用化學發(fā)光法檢測透明質酸酶(HA,試劑盒購自鄭州安圖生物工程股份有限公司)、Ⅲ型前膠原(PC-Ⅲ，試劑盒購自上海彩佑生物科技有限公司)、Ⅳ型膠原(C-Ⅳ，試劑盒購自南京萊富賽生物科技有限公司)、層黏連蛋白(LN，試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司)，具體操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 各組血清外泌體HBV-DNA 載量及miR-122、miR-146a表達水平比較 與健康對照組比較，低、中、高載量組血清外泌體HBV-DNA 載量及miR-122水平依次增加，miR-146a表達水平均依次降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2 各組血清肝纖維化指標水平比較 與健康對照組比較，低、中、高載量組血清肝纖維化指標HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均依次增加，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3 CHB患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達水平及HBV-DNA 載量的相關性 血清外泌體miR-122與miR-146a水平呈負相關(r=-0.765，P=0.000)，與HBV-DNA 載量呈正相關(r=0.773，P=0.000)；miR-146a與HBV-DNA 載量呈負相關(r=-0.840，P=0.000)。

2.4 CHB患者血清外泌體miR-122、miR-146a表達水平與肝纖維化指標的相關性 血清外泌體miR-122水平與HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈正相關(r=0.764、0.699、0.665、0.697，P均<0.01)，miR-146a水平與HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈負相關(r= -0.779、-0.731、-0.691、-0.738，P均<0.01)。

3 討 論

外泌體廣泛存在于血清、尿液、乳汁等多種細胞液中，其內容物包括特性蛋白、脂質、DNA、mRNA及miRNA等多種分子，可參與細胞信號傳導、物質傳遞、血管生成、炎性反應及免疫調節(jié)等生理病理過程。與游離性miRNA相比，外泌體源性miRNA穩(wěn)定性及抗降解能力更強，在CHB及肝細胞癌診斷及靶向治療中意義重大[11-14]。因此本研究以血清外泌體為研究材料進行試驗。

表1 4組受試者血清外泌體HBV-DNA 載量及miR-122、miR-146a表達水平比較

表2 4組受試者血清肝纖維化指標水平比較

研究報道， miR-122與CHB密切相關，是一種肝損傷標志性miRNA[15]。王福玲[16]研究報道，血清miR-122水平隨HBV-DNA載量增加而升高，與HBV-DNA載量呈正相關。Mosedale等[17]研究報道，外泌體miR-122水平在藥物性肝損傷細胞中顯著增加，與細胞程序性死亡及細胞膜通透性增加有關。Jiao等[18]研究報道，持續(xù)病毒應答組血清和外泌體miR-122-5p水平均顯著高于無應答組，miR-122-5p可作為丙型病毒性肝炎診療的生物標志。本研究結果發(fā)現，與健康對照組比較，HBV-DNA低、中、高載量組血清外泌體miR-122表達水平隨HBV-DNA載量增加而增加，且與肝纖維化指標HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈正相關。HA是一種廣泛存在于細胞外基質中的高糖分子，主要在肝內皮細胞中降解，肝臟組織受損時，對HA降解能力下降，導致血清HA水平增加。PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN是肝硬化早期指標，可反映肝纖維化程度。提示血清外泌體miR-122水平增加可能與CHB患者HBV-DNA復制及肝纖維化有關，影響CHB發(fā)生發(fā)展。

miR-146a與多種慢性炎性疾病有關，可參與天然免疫和獲得性免疫過程，在肝臟疾病中亦發(fā)揮重要作用[7, 19]。馬宏豐等[20]研究報道，miR-146a在原發(fā)性肝癌組織及HepG2細胞中均顯著下調，過表達miR-146a可降低HepG2細胞增殖，抑制其遷移及侵襲。周興宏等[21]研究報道，三七皂苷R1可通過上調miR-146a水平減輕ApoE-/-小鼠血糖血脂水平，保護小鼠肝臟炎性反應損傷。本結果發(fā)現，血清外泌體miR-146a表達水平隨HBV-DNA載量增加而降低，與miR-122、HA、PC-Ⅲ、C-Ⅳ、LN水平均呈負相關，提示CHB患者血清外泌體miR-146a可能對miR-122起拮抗作用，影響HBV-DNA復制及肝纖維化進程，血清外泌體miR-122、miR-146a水平有望成為CHB患者靶向治療的新型標志物。

綜上所述，CHB患者血清外泌體miR-122隨HBV-DNA 載量增加而升高，miR-146a水平呈相反趨勢，二者可能拮抗影響HBV-DNA 復制及肝纖維化程度。關于miR-122、miR-146a參與CHB發(fā)生發(fā)展的具體炎性反應相關通路尚不完全清楚，有待加大樣本量進一步深入探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

劉嬌：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；劉青：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核；王大明：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；賈興旺：進行統(tǒng)計學分析；陶淑慧、徐建國：課題設計，論文撰寫