盛李明 崔曉穎 程蕾 陳影 杜向慧

順鉑為基礎的同步放化療是局部晚期頭頸部鱗癌的標準治療方法，但由于患者對順鉑存在耐藥現(xiàn)象，同步放化療后的生存情況仍不理想，如何克服順鉑耐藥是當前的研究熱點之一，深入理解耐藥機制是當前亟待解決的問題[1-2]。穩(wěn)定的頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞系是研究耐藥機制的主要對象，但目前尚缺乏成熟的順鉑耐藥細胞系。本研究以頭頸部鱗癌細胞系FaDu、UD-SCC-4及UM-SCC-22B為基礎對象，采用順鉑濃度遞增、間歇誘導的方法獲取頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞系，鑒定順鉑耐藥特性，同時探討順鉑耐藥與細胞表面受體編碼基因Notch1表達的關系，以初步明確Notch1信號通路在頭頸部鱗癌順鉑耐藥過程中的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 細胞系 人頭頸部鱗癌細胞系FaDu購自美國ATCC公司，UD-SCC-4、UM-SCC-22B分別來自于德國Dusseldorlf大學和美國Michigan大學的頭頸部鱗癌實驗室。

1.2 主要藥品和試劑 順鉑購自德國Sigma-Aldrich公司。MEM培養(yǎng)基和10% FBS均購自美國GIBCO公司，噻唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）購自美國 Roth公司，Notch1抗體購自美國Santa Cruz公司，內(nèi)參蛋白Vinculin抗體購自英國Abcam公司，BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific公司，高純RNA分離試劑盒購自美國Roch公司，F(xiàn)irst strand cDNA synthesis Omniscript RT試劑盒購自美國Qiagen公司。

1.3 頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞系的建立 將頭頸部鱗癌細胞系FaDu、UD-SCC-4和UM-SCC-22B培養(yǎng)于含10% FBS的MEM培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37℃、潮濕環(huán)境的培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的鱗癌細胞，然后接種至含一定濃度順鉑的MEM培養(yǎng)基中處理2～4 h，棄上清液，加入新的MEM培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)進行細胞培養(yǎng)，待其恢復至對數(shù)生長期時，重復上述操作，但順鉑的濃度逐漸增加，歷時4～9個月（各細胞系需要的順鉑濃度和時間均不一樣）。經(jīng)多次MTT檢測，成功獲取相應的頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞系FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R和 UM-SCC-22BDDP-R。

1.4 順鉑耐藥細胞系耐藥指數(shù)的測定 采用MTT法。使用0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的鱗癌細胞并制作成單細胞懸液，然后接種于96孔板24 h，每孔250個細胞，每組設6個復孔，待細胞貼壁，使用含不同濃度順鉑的MEM培養(yǎng)基處理細胞7～10 d，待未經(jīng)順鉑處理的細胞貼壁密度為70%～85%時終止培養(yǎng)，每孔加入20 μl MTT溶液，放回培養(yǎng)箱孵育1 h，棄培養(yǎng)基；每孔加入二甲基亞砜150 μl，振蕩10min。使用酶標儀于檢測每孔540 nm處的吸光度值（A），計算細胞存活率；細胞存活率=（A處理組/A對照組）×100%。重復上述試驗3次，計算順鉑半數(shù)抑制藥物濃度（IC50），計算耐藥細胞系的耐藥指數(shù)；耐藥細胞系的耐藥指數(shù)=耐藥細胞系IC50/原細胞系IC50。

1.5 原鱗癌細胞系及其耐藥細胞系Notch1蛋白表達檢測 采用Western blot法。取對數(shù)生長期的鱗癌細胞，使用RIPA裂解液進行細胞裂解，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，然后將相同質(zhì)量的蛋白加入到8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中。每孔加入50 μg蛋白樣本，恒壓電泳，然后將SDSPAGE凝膠恒流轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，使用5%脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，洗膜后加入一抗（Anti-Notch1，1∶1 000），置于 4 ℃冰箱過夜。使用 1×TBST 緩沖液洗膜3次，10 min/次；加入1∶15 000稀釋于5%脫脂奶粉中的辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫下孵育1 h；再次使用 1×TBST緩沖液洗膜 3次，10 min/次；1×TBS緩沖液洗膜10 min。采用ECL plus化學發(fā)光法進行顯色，使用Fuji X線片曝光蛋白信號。

1.6 原鱗癌細胞系及其耐藥細胞系Notch1 mRNA表達檢測 采用qRT-PCR法。使用高純RNA分離試劑盒提取RNA，使用Nanophotometer儀檢測其濃度及純度；使用First strand cDNA synthesis Omniscript RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；根據(jù)Genebank上的NOTCH1基因序列在UPL probe上設計目的基因及內(nèi)參基因（β-tubulin）的引物。NOTCH1基因上游引物：5′-CAGCCAGTGCAACTCAAGC-3′，下游引物：5′-TCCTTGCAGTACTGGTCGTACA-3′；β -tubulin 上 游 引 物 ：5′-CCCCTTCAAGTTCTAGTCTGC-3′，下游引物：5′-GCATTGCCAATCTGGACAC-3′。使用Light Cycler儀進行qRTPCR，反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃1 min，共50個循環(huán)。每個樣本重復3次，每次設3個復孔。采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量，其中Ct值為熒光信號達到閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 順鉑耐藥細胞系的耐藥指數(shù) 不同濃度順鉑處理頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系后細胞存活率見圖1；頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系對順鉑的 IC50見表 1。FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R和 UM-SCC-22BDDP-R對順鉑的耐藥指數(shù)分別為5.72±0.39、7.41±1.19和 3.29±0.16。

2.2 頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系Notch1蛋白表達比較 FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R的F-Notch1及活化的C-Notch1蛋白表達均高于原鱗癌細胞系；而UM-SCC-22B及其耐藥細胞系上未見Notch1蛋白表達，見圖2。

圖 1 不同濃度順鉑處理頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系后細胞存活率（a：FaDu；b：FaDuDDP-R；c：UD-SCC-4；d：UD-SCC-4DDP-R；e：UM-SCC-22B；f：UM-SCC-22BDDP-R）

表1頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系對順鉑的IC50（mg/L）

2.3 頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系Notch1 mRNA相對表達量比較 與原鱗癌細胞系比較，UDSCC-4DDP-R的Notch1 mRNA相對表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而 FaDuDDP-R與 FaDu、UD-SCC-4DDP-R與UM-SCC-22B的Notch1 mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

圖2 頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系Notch1蛋白表達的電泳圖

3 討論

以順鉑為基礎的同步放化療及輔助治療，能夠有效地提高頭頸部鱗癌患者的局部控制率，減少遠處轉(zhuǎn)移[3]；同時能更好地保留頭頸部重要器官功能[4]。2009年一項基于93項隨機對照試驗的Meta分析結(jié)果顯示，與單純放療比較，局部晚期頭頸部鱗癌患者行序貫化療能將5年生存率提高4.5%，同步化療則能提高6.5%，提示患者更能從以順鉑為基礎的化療中獲益[5]。順鉑雖然是局部晚期頭頸部鱗癌一線治療方案的首選藥物，但由于其耐藥現(xiàn)象的存在，一線方案治療效果仍較差。如何克服順鉑耐藥現(xiàn)象，不僅對頭頸部鱗癌的意義重大，對肺癌、食管癌、宮頸癌等使用順鉑化療的癌種也意義重大。目前尚缺乏成熟、穩(wěn)定的頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞系，本研究通過順鉑濃度遞增、間歇誘導的方法建立了3種頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞株，并經(jīng)MTT法檢測發(fā)現(xiàn)這3種耐藥細胞系對順鉑的耐藥指數(shù)高于原頭頸部鱗癌細胞系，其中UD-SCC-4DDP-R的耐藥指數(shù)最高，是以后研究順鉑耐藥的最佳研究模型。

表2 頭頸部鱗癌細胞系及其順鉑耐藥細胞系Notch1 mRNA相對表達量比較

Notch信號通路是一類高度進化保守的信號通路，在多能祖細胞發(fā)育、組織更新及干細胞分化中起著重要作用[6]。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物中有4種Notch（Notch1、Notch2、Notch3、Notch4）受體及 5 種配體（Jag1、Jag2、Dll 1、Dll 13、Dll 14等）。順鉑耐藥細胞系的Notch1蛋白表達較原頭頸部鱗癌細胞系明顯升高，表明Notch1蛋白過表達與頭頸部鱗癌順鉑耐藥現(xiàn)象有關。Notch1過表達后，可通過γ-enolase途徑增加c-myc的活性，從而誘導順鉑耐藥的發(fā)生[7-11]。體外研究發(fā)現(xiàn)，γ-分泌酶抑制劑能夠通過抑制Notch1蛋白活性來增加順鉑治療的敏感性[12]。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，Notch1過表達患者使用順鉑化療后，易出現(xiàn)早期治療失敗[13]。以上研究結(jié)果均表明Notch1在頭頸部鱗癌上表現(xiàn)出癌基因的特點。在本研究中，Notch1蛋白及mRNA表達在UD-SCC-4及其順鉑耐藥細胞株上存在一致性，這與Krikelis等[14]研究結(jié)果一致；但在FaDu及其耐藥細胞株上兩者表達不一致，這與既往關于喉癌細胞株的一項研究結(jié)果類似[15]。雖然FaDu和UD-SCC-4同屬于頭頸部鱗癌，但是FaDu細胞來源于喉咽癌，而UD-SCC-4細胞來源于口咽癌，組織來源上的差異可能導致了蛋白及mRNA表達的不一致。

綜上所述，本研究初步建立了3種頭頸部鱗癌順鉑耐藥細胞系（FaDuDDP-R、UD-SCC-4DDP-R和UM-SCC-22BDDP-R），均有順鉑耐藥的生物學特性，且與Notch1表達有關。