賈 方，王秋月，崔文靜，張 軼，王菊勇

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院(上海 200032)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，2018年全球肺癌新發(fā)病例約209萬例，死亡約176萬例，分別占惡性腫瘤新發(fā)病例11.6%和死亡病例18.4%，居惡性腫瘤第一位[1]。近年來研究者發(fā)現(xiàn)程序性死亡受體-1(Programmed death receptor 1,PD-1)及其配體(Programmed death ligand 1,PD-L1)參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，PD-1/PD-L1信號(hào)通路在肺癌細(xì)胞中異常表達(dá)，表明其與肺癌發(fā)生發(fā)展及抗腫瘤負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)有密切關(guān)系。金復(fù)康口服液是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院、國醫(yī)大師劉嘉湘先生的臨床實(shí)踐總結(jié)并研制而成，在治療肺癌方面具有良好的療效及安全性[2]。本研究將 Lewis 肺癌細(xì)胞移植瘤小鼠為動(dòng)物模型，研究金復(fù)康口服液對(duì)荷瘤小鼠抑瘤作用，并從調(diào)節(jié)PD-1、PD-L1表達(dá)及免疫相關(guān)因子方面對(duì)其提高免疫功能抗腫瘤作用進(jìn)行探討。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞株：近交系C57BL/6小鼠，6～8周，無特殊病原體，雄性，體質(zhì)量(20±2)g,32只；動(dòng)物級(jí)別SPF級(jí)，購自上海靈暢生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬)2018-0003。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，室溫為25 ℃，濕度為70%，自由攝食和飲水。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株由中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供，使用10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素/鏈霉素的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)，于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器：金復(fù)康口服液由吉林三九金復(fù)康藥液有限公司提供，每毫升含1 g生藥(批號(hào)：181001)。注射用順鉑(凍干型)(國藥準(zhǔn)字 H20023461)，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院西藥房提供，用生理鹽水稀釋至0.734 mg/ml。DMEM (Hyclone),PBS(天津?yàn)?,胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(Hyclone)，胎牛血清(Gibco),BCA蛋白定量試劑盒(碧云天)，10%凝膠試劑盒(雅酶),ECL 超敏發(fā)光試劑盒(碧云天),兔抗小鼠PD-1/PD-L1單克隆抗體(Abcam),HRP標(biāo)記的二抗(arigo),RNA提取試劑盒(EZBioscience生物)，DNA引物(上海生工生物工程有限公司),TAKARA_RR047A PrimeScript RT reagent Kit，TAKARA_RR420A TB Green Premix Ex Taq，ELISA檢測(cè)試劑盒(司鼎生物),電子天平(BSA623S賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)MCO-18AIC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)、MSC-Advantage生物安全柜(Thermo Fisher，美國)，低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，DMI3000B倒置顯微鏡購(Leica德國)，組織研磨儀(必橫生物) GelDoc XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)Mini-PROTEANRTetra蛋白垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)，EC3410化學(xué)發(fā)光成，像系統(tǒng)(UVP，美國)，Nano Drop 2000C超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher，美國),Step One Plus熒光定量PCR(ABI，美國),infinite F200多功能酶標(biāo)檢測(cè)儀(TECAN，瑞士)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組:采用對(duì)數(shù)生長期Lewis肺癌細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×107個(gè)/ml。用 1 ml注射器吸取Lewis細(xì)胞懸液0.2 ml(含細(xì)胞數(shù)2×106個(gè))注射于C57BL/6小鼠右腋部皮下，完成小鼠皮下移植瘤的接種。 造模后隨機(jī)將小鼠分為四組且每組8只，分別為模型組和金復(fù)康低、中、高劑量組。給藥方式：模型組給予生理鹽水0.2 ml，金復(fù)康低劑量組為15 g/kg，金復(fù)康中劑量組為30 g/kg，金復(fù)康高劑量組為60 g/kg，均為每日灌胃1次,連續(xù)14 d。

2.2 小鼠移植瘤質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率：第14天小鼠脫頸椎處死并取腫瘤組織，用電子天平稱量瘤體質(zhì)量，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質(zhì)量-治療組平均瘤質(zhì)量)/模型組平均瘤質(zhì)量×100%。

2.3 熒光定量PCR檢測(cè)肺癌小鼠腫瘤組織PD-1/PD-L1 mRNA的含量：隨機(jī)取腫瘤組織20 mg，每組4個(gè)，使用組織研磨儀研磨，制備細(xì)胞懸液。根據(jù)組織RNA提取試劑盒提取，然后超微量分光光度儀測(cè)各樣本濃度(吸光度值260/280≈1.8)。參照逆轉(zhuǎn)錄酶說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)目的基因cDNA序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物,序列見表1。采用熒光定量PCR法，反應(yīng)體系為20 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃2 min變性后，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次。PD-1(PD-L1)/GAPDH比值采用 2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)水平。見表1。

2.4 Western blot法檢測(cè)肺癌小鼠腫瘤組織PD-1/PD-L1 蛋白表達(dá)水平：提取各組小鼠腫瘤組織的蛋白，配膠后經(jīng)電泳蛋白分離后，將蛋白轉(zhuǎn)印于PVDF 膜上，5%脫脂奶粉搖床上封閉1 h，加入兔單克隆PD-1抗體、PD-L1 抗體(1∶1000)，4 ℃孵育12 h。TBST洗滌4次，8 min/次，而后加二抗即山羊抗兔IgG(1∶10000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，8 min/次。使用化學(xué)發(fā)光顯像系統(tǒng)曝光，后用Image J蛋白分析軟件分析，結(jié)果取相對(duì)平均表達(dá)量。

表1 引物序列

2.5 肺組織切片HE染色：石蠟包埋肺組織，每個(gè)標(biāo)本切取三張片子，常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染1 min自來水沖洗1 min，鹽酸酒精3 s,流水沖洗5 min,伊紅染色10 s，梯度酒精上行脫水，二甲苯透明Ⅰ、Ⅱ各20 min,中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

2.6 小鼠血清中IFN-γ和 IL-12檢測(cè)：從給藥開始第14天，將Lewis肺癌小鼠異氟烷麻醉后摘眼球取血，離心分離血清(7000 rpm×5 min)。按照IFN-γ和 IL-12 試劑盒說明書操作，將酶標(biāo)儀設(shè)置450 nm檢測(cè)各孔吸光度并計(jì)算IFN-γ和IL-12水平。

結(jié) 果

1 金復(fù)康口服液對(duì)Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用見表2。在接種Lewis 肺癌細(xì)胞約3 d左右，荷瘤對(duì)照組和低劑量組可觸及皮下結(jié)節(jié)，而后逐漸增大，中藥中、高劑量組約5 d左右觸及皮下結(jié)節(jié)，其中，金復(fù)康中、高劑量組生長較緩慢。各組的抑瘤結(jié)果顯示：中藥中、高劑量組抑瘤作用明顯，與模型組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較

2 金復(fù)康口服液對(duì)小鼠腫瘤組織中 PD-1及PD-L1 mRNA表達(dá)水平的影響 見表3。與模型組相比，低、中、高劑量組進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示金復(fù)康口服液中、高劑量組降低PD-L1 mRNA的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量組能升高PD-1 mRNA的表達(dá)，中、高劑量組降低PD-1 mRNA的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 金復(fù)康口服液對(duì)腫瘤組織中

3 金復(fù)康口服液對(duì)小鼠腫瘤組織 PD-1 及PD-L1 蛋白表達(dá)水平的影響 見表4。與模型組比較，金復(fù)康口服液中、高劑量組對(duì)PD-1、PD-L1 的表達(dá)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組比較，金復(fù)康口服液中劑量組對(duì)PD-1的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，高劑量組對(duì)PD-L1的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果提示，金復(fù)康口服液能夠降低腫瘤組織PD-1及PD-L1表達(dá)。

表4 金復(fù)康口服液對(duì)小鼠腫瘤組織中PD-1及PD-L1

4 金復(fù)康口服液對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)的影響 模型組和低劑量組可觀察細(xì)胞形態(tài)大小不一且排列不規(guī)則，有明顯癌巢，細(xì)胞分化差，核大深染，多見核分裂相，且肺組織形態(tài)破壞嚴(yán)重；中劑量、高劑量組則肺泡形態(tài)較好，肺組織形態(tài)完整，未見明顯癌巢，細(xì)胞形態(tài)均一、分化較好(圖1)。

5 金復(fù)康口服液對(duì)小鼠血清中相關(guān)免疫因子(IFN-γ、IL-12)的作用 見表5。中、高劑量組與模型組比較IFN-γ均上升，且中劑量與低劑量組比較IFN-γ升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量組與模型組比較IL-12上升差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而金復(fù)康口服液高劑量組IL-12 與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表明金復(fù)康口服液能夠提高荷瘤宿主血清IFN-γ、IL-12的含量。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE染色，×200)

表5 金復(fù)康口服液對(duì)小鼠血清中IFN-γ、IL-12的作用

討 論

機(jī)體在正常狀況下出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞時(shí)，能夠通過免疫監(jiān)視產(chǎn)生免疫應(yīng)答殺死腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞通過上調(diào)免疫抑制細(xì)胞或下調(diào)免疫激活細(xì)胞抑制免疫應(yīng)答，促使其發(fā)生免疫逃逸。PD-1(CD279)在人類和小鼠活化的T、B細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)及單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞中表達(dá)[3-4]。配體PD-L1 主要在腫瘤細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞(APC)上表達(dá)[5-6]。PD-1與PD-L1的相互作用發(fā)生在腫瘤微環(huán)境中。激活PD-1及PD-L1信號(hào)通路可形成免疫抑制性腫瘤微環(huán)境[7-8]，故而阻斷該通路則可逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞的殺傷能力,從而改善惡性腫瘤患者預(yù)后情況[9]。研究顯示在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、胃癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中PD-L1表達(dá)升高，并與這些腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)[10]。PD-1及PD-L1信號(hào)通路已經(jīng)成為免疫檢查點(diǎn)治療新靶點(diǎn)，是調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌T細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)鍵抑制途徑。故而探索阻斷PD-1及PD-L1信號(hào)通路的中藥復(fù)方，從而提高免疫功能，改善腫瘤免疫環(huán)境。

肺癌屬中醫(yī)“肺積”“息賁”“痰飲”等病的范疇?！夺t(yī)宗必讀》談到“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之。”“正氣”指機(jī)體對(duì)致病因素的防御和抵抗能力，與西醫(yī)學(xué)的免疫功能有異曲同工之意。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤的免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)。金復(fù)康口服液主要由黃芪、北沙參、淫羊藿、絞股藍(lán)、石上柏、重樓等十二味中藥組成，以益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)腎培本等扶正藥物為主，主要針對(duì)非小細(xì)胞肺癌氣陰兩虛證，其通過增強(qiáng)人體抗病能力，達(dá)到控制或縮小腫瘤的目的。臨床研究表明金復(fù)康口服液可提高非小細(xì)胞肺癌患者生存率，改善臨床癥狀，抑制腫瘤復(fù)制、侵襲及轉(zhuǎn)移，增加化療療效，減輕毒副作用[11-12]。實(shí)驗(yàn)研究表明金復(fù)康口服液能夠提高NK、LAK、IL-2的水平[13]，誘導(dǎo)循環(huán)腫瘤細(xì)胞衰老[14]，調(diào)節(jié)肺癌Th1、Th2失衡等[15]。本研究擬從PD-1及PD-L1角度研究金復(fù)康口服液提高免疫細(xì)胞抗腫瘤的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)金復(fù)康口服液對(duì)肺癌移植瘤及肺轉(zhuǎn)移具有一定的抑制作用。從mRNA和蛋白水平而言，金復(fù)康口服液能夠顯著降低腫瘤組織 PD-1及PD-L1 水平，以中、高劑量組效果較好，且升高血清中免疫因子IFN-γ、IL-12的表達(dá)含量，提示一定劑量的金復(fù)康口服液在荷瘤小鼠體內(nèi)可能通過抑制腫瘤中PD-1及PD-L1 水平，恢復(fù)CTL細(xì)胞活性從而增強(qiáng)淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤殺傷能力，同時(shí)增加炎癥細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤作用。這為我們接下來進(jìn)一步研究金復(fù)康口服液調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境抗腫瘤的分子機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。