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        一株青枯菌拮抗細(xì)菌M26的篩選、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

        2020-10-20 06:48:48陳丹丹李圓圓齊素敏冉新炎韓廣泉陶寧王麗榮
        山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年9期
        關(guān)鍵詞:青枯病芽孢番茄

        陳丹丹,李圓圓,齊素敏,冉新炎,韓廣泉,陶寧,王麗榮

        (山東碧藍(lán)生物科技有限公司/泰安市植物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 泰安 271000)

        番茄(Solanum lycopersicum L.)是管狀花目茄科番茄屬一年或多年生草本植物,為我國(guó)主要的蔬菜之一。番茄營(yíng)養(yǎng)豐富,其含有的番茄紅素具有抗氧化、清除自由基、延遲衰老和抗癌的功效[1],具有很大的經(jīng)濟(jì)效益。隨著番茄種植面積的不斷擴(kuò)大,番茄青枯病也越來(lái)越嚴(yán)重。番茄青枯病是由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一種常見(jiàn)的維管束系統(tǒng)性病害之一,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成植株死亡,導(dǎo)致番茄嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收[2]。

        利用生防菌防治番茄土傳病害是一種有應(yīng)用前景的防治措施[3]。芽孢桿菌(Bacillus)是一類研究較多的生防細(xì)菌,當(dāng)前用于防治青枯病的芽孢桿菌有解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)[4-6]、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[7,8]、短短芽孢桿菌(Brevibacillus brevis)[9]、蠟狀芽孢桿菌(B.cereus)[10]、耐寒短桿芽孢桿菌(Brevibacterium frigoritolerans)[11]、特基拉芽孢桿菌(B.tequilensis)[11]、多 粘 芽 孢 桿 菌(Paenibacillus polymyxa)[12]等。美國(guó)迄今已有1個(gè)解淀粉芽孢桿菌FZB42和3個(gè)枯草芽孢桿菌GB03、MB1600、QST713獲得商品化生產(chǎn)許可[13]。

        本試驗(yàn)篩選到一株抑制青枯雷爾氏菌的細(xì)菌M26,通過(guò)16S rRNA基因序列、形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析,確定其為解淀粉芽孢桿菌,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,為開(kāi)發(fā)該菌株成為青枯病生防菌提供參考,同時(shí)豐富了防治青枯病的微生物資源。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        供試菌株:青枯雷爾氏菌,購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;其他菌株由山東碧藍(lán)生物科技有限公司菌種保藏中心保存。

        供試培養(yǎng)基:芽孢培養(yǎng)基(YB):葡萄糖2 g,蛋白胨10 g,酵母膏5 g,氯化鈉5 g,水1 L,pH=7.0,固體培養(yǎng)基(YA)加瓊脂粉15 g;青枯培養(yǎng)基:蛋白胨5 g,葡萄糖5 g,酵母提取物0.2 g,牛肉提取物3 g,氯化鈉0.5 g,七水硫酸鎂1.5 g,水1 L,pH =7.0,固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15 g和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)100μL;2%營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA):蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,水1 L,pH值為7.2~7.4,瓊脂粉20 g,1%NA培養(yǎng)基加瓊脂粉10 g。所有培養(yǎng)基121℃滅菌30 min備用。

        主要試劑和儀器:葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯化鈉等,均為分析純?cè)噭?;天根?xì)菌基因組DNA提取試劑盒;PCR引物,由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司合成;HBI芽孢桿菌生化鑒定條,由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);BIO-RAD PCR儀,伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司;OLYMPUS CX31型顯微鏡,日本奧林巴斯株式會(huì)社;DYY-6C型電泳儀,北京市六一儀器廠;T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TANON-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng),上海天能科技有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 拮抗菌的初篩 菌液的制備:將青枯菌接種于青枯液體培養(yǎng)基中,30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)48 h后備用;將保存的拮抗菌接種到Y(jié)B培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h后備用。

        初篩方法:采用平板孔擴(kuò)散法。底層為20 mL的2% NA培養(yǎng)基,待培養(yǎng)基凝固后加入1 mL的青枯菌和5 mL的1% NA培養(yǎng)基搖勻,等液體干透后用打孔器(直徑9 mm)距離中心3 cm打4個(gè)孔,每孔中加100μL的生防菌液,每個(gè)處理重復(fù)3次,抑菌圈直徑按十字交叉法進(jìn)行測(cè)量。

        1.2.2 拮抗菌的復(fù)篩 從初篩結(jié)果中選取抑菌效果比較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩,方法如1.2.1,選出抑制效果最好的1株細(xì)菌。

        1.2.3 拮抗菌的鑒定 利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA,使用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50μL):DNA模板2 μL,Mix 25μL,27F 1μL,1492R 1μL,ddH2O 21 μL。PCR擴(kuò)增程序:95℃4 min;94℃30 s,52℃80 s,72℃90 s,30個(gè)循環(huán);72℃8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序后的拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST相似序列檢索比對(duì),采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

        形態(tài)學(xué)和理化特征試驗(yàn):將拮抗菌接種于YA培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、凹凸度、透明度等,并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色[14],具體方法參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[15]。

        1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化 (1)種子液制備:將復(fù)篩得到的拮抗菌接種至YB培養(yǎng)基中,37℃、180 r/min培養(yǎng)24 h待用。

        (2)發(fā)酵條件優(yōu)化:按照1/15(V/V)的接種量接種于YB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別檢測(cè)不同溫度(25、30、35、45、55℃)、不同pH值(5、6、7、8、9)、不同NaCl含量(0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)、不同轉(zhuǎn)速(150、180、210 r/min)、不同裝載量(15%、25%、40%、50%)下600 nm的光密度值,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        采用SPSS軟件包單因素方差分析法(oneway ANOVA)中的Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05),利用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 拮抗菌的篩選

        選取保存的40株菌進(jìn)行純化,編號(hào)為M1、M2、… 、M40。有5株細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)的抑制作用,抑制結(jié)果如表1所示。其中菌株M26對(duì)青枯雷爾氏菌具有很強(qiáng)的抑制作用,抑菌圈直徑達(dá)14.34 mm,復(fù)篩平均抑菌圈直徑達(dá)15.22 mm。經(jīng)過(guò)連續(xù)多次試驗(yàn)后抑菌效果穩(wěn)定(圖1),所以對(duì)菌株M26進(jìn)行進(jìn)一步研究。

        表1 5株細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑 (mm)

        2.2 M26菌株16S rRNA基因序列分析

        電泳結(jié)果(圖2)顯示,PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在1 500 bp左右。測(cè)序結(jié)果顯示M26菌株16S rRNA基因的序列長(zhǎng)度為1 453 bp,與電泳結(jié)果一致。M26與Bacillus amyloliquefaciens strain BA31(MG548650)相似性達(dá)到99.79%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也顯示M26與B.amyloliquefaciens strain BA31(MG548650)在同一系統(tǒng)分支上(圖3)。因此,初步鑒定M26為解淀粉芽孢桿菌。

        圖1 M26菌株對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制效果

        圖2 M26菌株16S rRNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

        圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的M26及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

        2.3 菌株M26的形態(tài)和生理生化特征

        菌株M26在YA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h后,菌體呈桿狀,有莢膜和芽孢;菌落為乳白色,呈圓形,直徑在0.35~0.45 cm,表面有褶皺,中心部分凸起,邊緣為鋸齒狀,不透明,不產(chǎn)生色素。部分生理生化特征見(jiàn)表2,與B.amyloliquefaciens的生理生化特征[16,17]最為接近。

        表2 M26菌株的生理生化特征

        2.4 菌株M26的發(fā)酵條件優(yōu)化

        由圖4可知,菌株M26在25~55℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),25℃和35℃的差異不顯著,但是在25℃時(shí)生長(zhǎng)最好(圖4 A);在25℃條件下,M26在pH值5~9范圍內(nèi)均能生長(zhǎng),在pH=7下生長(zhǎng)最好(圖4 B);在25℃、pH=7條件下,M26在NaCl含量為0~2%的條件下均能生長(zhǎng),0.5%NaCl含量下生長(zhǎng)最好(圖4 C);在25℃、pH=7、0.5%NaCl含量下,180 r/min下OD600顯著低于150 r/min和210 r/min,在150 r/min條件下生長(zhǎng)最好(圖4 D);在上述優(yōu)化條件下,裝載量為40%下生長(zhǎng)的最好(圖4 E)。綜上可知:解淀粉芽孢桿菌M26在25℃、pH=7、0.5%NaCl含量、轉(zhuǎn)速為150 r/min、40%裝載量條件下生長(zhǎng)的最好。

        圖4 不同發(fā)酵條件下菌株M26的生長(zhǎng)情況

        3 討論與結(jié)論

        解淀粉芽孢桿菌可通過(guò)產(chǎn)生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)抑制植物病原菌、真菌、病毒和線蟲(chóng)[18-20]。其易于生產(chǎn),對(duì)環(huán)境友好,是一類重要的生防資源[21]。有研究表明:解淀粉芽孢桿菌對(duì)番茄青枯菌有很強(qiáng)的拮抗作用[22,23];枯草芽孢桿菌、解淀粉桿菌和地衣芽孢桿菌能夠抑制青枯病的發(fā)生,且枯草芽孢桿菌抑菌能力最強(qiáng),可使感染率降低80%[24];解淀粉芽孢桿菌BS2004、SQY162和SQRT3對(duì)番茄青枯病的防治效果在70%以上,最高可達(dá)到81.25%,且均能夠促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)[25-27]。

        解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的親緣性很高,對(duì)人體及其它生物無(wú)害,因此被廣泛應(yīng)用于飼料、植物病害防治及果蔬保鮮中[28]。本研究對(duì)菌株M26的發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化時(shí),在45℃生長(zhǎng)最差,而在35℃和25℃均生長(zhǎng)良好。符可芯等[17]的研究表明,解淀粉芽孢桿菌在高于45℃時(shí)菌體生長(zhǎng)放緩,OD值下降,且在55℃的OD值高于25℃的,與本研究結(jié)果不一致,可能是解淀粉芽孢桿菌菌株的差異性所造成的。劉芳等[21]的研究表明,隨著溫度的升高,枯草芽孢桿菌BZJN1的芽孢數(shù)減少,45℃時(shí)降到最低,與本研究結(jié)果一致。

        通過(guò)分析M26菌株的16S rRNA序列、形態(tài)和生理特征,確定M26為解淀粉芽孢桿菌。M26菌株的最佳培養(yǎng)條件為溫度25℃、pH=7、0.5%NaCl含量、轉(zhuǎn)速150 r/min、裝載量40%。本試驗(yàn)為解淀粉芽孢桿菌的生產(chǎn)工藝提供了參考數(shù)據(jù)。

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