侯江厚，張靈霞，孫雯娜，劉艷華，楊秉芬，孫衛(wèi)國

（1.昆明市婦幼保健院，云南 昆明 650013；2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心結(jié)核病研究所全軍結(jié)核病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091）

人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因，其中HPV16型與宮頸癌的關(guān)系最為密切[1]。另外，其他癌癥，如喉癌、食管癌、骨髓癌等也與HPV16型感染相關(guān)[2]。HPV基因是雙鏈閉環(huán)DNA分子，編碼含有10個開放閱讀框架，晚期編碼區(qū)的L1蛋白結(jié)構(gòu)比較保守，是HPV主要的病毒衣殼蛋白，其含有多個線性表位和構(gòu)象表位，這些表位分散于整個病毒衣殼的表面，是誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性體液免疫反應(yīng)的主要抗原[3-4]。L1基因的最初129個核苷酸中有1個主要的RNA抑制因子[5]，該蛋白N端由15～30個疏水性氨基酸殘基組成1個保守的疏水區(qū)，這種連續(xù)疏水性氨基酸的多肽不利于蛋白在原核系統(tǒng)中的表達(dá)，目前獲得L1重組蛋白大多采用酵母細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞[6]。利用原核系統(tǒng)表達(dá)L1雖然有諸多報道，但均未形成規(guī)模化商品，存在的問題主要是表達(dá)量太低、純化困難。本課題組前期通過序列分析軟件DNAStar對HPV16型L1蛋白的二級結(jié)構(gòu)、優(yōu)勢表位、親水性等多個參數(shù)進(jìn)行分析，比較蛋白序列潛在的B細(xì)胞表位，同時采用BLAST同源性匹配分析來保證預(yù)測表位的特異性[7]，最終篩選出其C端335～496位氨基酸序列作為L1蛋白B細(xì)胞表位的優(yōu)勢序列。孫衛(wèi)國等[8]利用構(gòu)建的原核融合表達(dá)載體pET-DsbC獲得多個抗原表位序列的原核可溶性表達(dá)并具有良好的生物活性，作為伴侶分子的DsbC能輔助底物蛋白進(jìn)行正確的空間折疊，可表現(xiàn)出重組抗原的空間表位，提高血清學(xué)應(yīng)用的敏感性。本研究擬將生物信息學(xué)預(yù)測的L1蛋白中的335～496位氨基酸序列通過構(gòu)建pET-DsbCHPV16 L1表達(dá)載體進(jìn)行原核重組、純化并檢測其免疫學(xué)活性，為后期HPV16型疫苗的研制，尤其是HPV感染的臨床血清學(xué)診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pET-DsbC、大腸埃希菌Rosetta（DE3）及其感受態(tài)細(xì)胞由結(jié)核病診療新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存。引物和全基因由華大基因公司合成，聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）所需試劑、常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司，蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量Marker DNA2000購自美國Sigma公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗人IgG抗體和化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。Ni-Sepharose chelating Sepharose Fast Flow親和樹脂填料購自美國GE公司，自行裝填純化柱。LB培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）配制試劑等均為分析純試劑。

10份HPV16型感染并發(fā)宮頸癌患者單人份血清樣本由昆明市婦幼保健院腫瘤科保存，經(jīng)PCR-熒光探針法（上海之江生物科技股份有限公司）和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）（上海盈公生物技術(shù)公司）檢測確認(rèn)為HPV16型陽性。10份健康人單人份血清由昆明市婦幼保健院體檢中心提供。

1.2 方法

1.2.1 全基因合成 根據(jù)谷鴻喜等[9]報道的中國婦女感染的HPV16型基因L1片段序列，對335～496位氨基酸對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行全基因合成，3'端加入大腸埃希菌終止密碼子taa。5'和3'端分別引入內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ位點(diǎn)序列，同時合成鑒定引物為：正義引物5'-gatactacacgcagtac-3'，T7反義引物5'-gctagttattgctcagc-3'。

1.2.2 pET-DsbC-HPV16 L1表達(dá)載體的構(gòu)建 采用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ對全基因合成的克隆載體pUC19- L1及表達(dá)載體pET-DsbC分別進(jìn)行雙酶切，回收酶切后的L1片段和pET-DsbC，按照摩爾比3∶1的濃度混合后于16 ℃恒溫條件下連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌Rosetta（DE3），采用菌落PCR篩選陽性克隆株并進(jìn)行測序鑒定，獲得表達(dá)菌株pET-DsbCHPV16 L1。

1.2.3 重組HPV16 L1蛋白的原核表達(dá)與純化 將保存的陽性工程菌株于37 ℃震蕩培養(yǎng)8 h后進(jìn)行活化，次日按1∶100比例轉(zhuǎn)種含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)菌生長A600nm值約為0.4時加入終濃度為0.3 m m o l的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG），然后37 ℃條件下誘導(dǎo)7 h，將沉淀菌體在冰浴狀態(tài)下進(jìn)行超聲破碎，取上清和沉淀分別進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），分析重組蛋白的表達(dá)形式。采用鎳離子螯合親和層析柱對上清進(jìn)行層析（流速為1 mL/min），PBS平衡層析柱5個柱積，以50 mmol/L咪唑除去菌體自身雜蛋白，以150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，采用12% SDS-PAGE分析重組蛋白的純度，計算純化得率。

1.2.4 重組HPV16 L1蛋白的免疫印跡法與ELISA分析 取保存的重組DsbC蛋白和重組融合蛋白DsbC-HPV16 L1，用PBS配制成1 mg/mL的母液備用，分別取2 μL進(jìn)行常規(guī)15%SDS-PAGE，半干法電轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，然后分別以1∶20稀釋后的宮頸癌患者陽性血清、體檢健康者血清進(jìn)行孵育，采用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate-buffered saline Tween，PBST）洗滌，以1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗人IgG抗體進(jìn)行第2次孵育，漂洗干凈后，通過化學(xué)發(fā)光暗室自動曝光顯影，采用免疫印跡法判斷該重組蛋白的抗原性。采用ELISA分析重組蛋白的免疫學(xué)活性。將用碳酸鈉鹽溶液稀釋的DsbC-HPV16 L1（終濃度為7 μg/mL）包被96孔酶標(biāo)板，以DsbC蛋白作為陰性對照（包被濃度7 μg/mL），每孔100 μL包被過夜，封閉、洗板，將用PBST 1∶20稀釋的HPV16型陽性血清和健康人血清分別加入包被孔和對照孔，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，充分洗板后每孔加入1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗人IgG抗體100 μL，37 ℃震蕩孵育30 min，充分洗板，加入四甲基聯(lián)苯胺，室溫避光反應(yīng)30 min，加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)。采用GEN-PROBD酶標(biāo)儀（美國ThermoFisher Scientific公司）檢測450 nm波長處的A值。

2 結(jié)果

2.1 pET-DsbC-HPV16 L1原核重組表達(dá)載體的構(gòu)建

對HPV16 L1蛋白的335～496位氨基酸對應(yīng)的核酸序列進(jìn)行分析，按大腸埃希菌密碼子偏性、使用頻率和優(yōu)化RNA結(jié)構(gòu)的原則進(jìn)行全基因合成，然后克隆到pET-DsbC表達(dá)載體上，以設(shè)計的鑒定引物進(jìn)行PCR鑒定，1%瓊脂糖核酸電泳顯示片段大小為570 bp，與預(yù)期值相符，見圖1。經(jīng)測序鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。

圖1 HPV16 L1 C端核酸PCR鑒定凝膠電泳結(jié)果

2.2 DsbC-HPV16 L1融合蛋白表達(dá)與純化

DsbC-HPV16 L1融合表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Rosetta（DE3）宿主菌后以IPTG誘導(dǎo)，可獲得目的蛋白的原核表達(dá)，冰浴超聲破碎后進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果顯示，在目的相對分子質(zhì)量46 000處（DsbC蛋白為28 000）有明顯的蛋白表達(dá)，目的蛋白占菌體蛋白的30%以上。超聲破碎后的上清液中可溶目的蛋白占表達(dá)蛋白的50%以上。見圖2。

圖2 HPV16 L1原核表達(dá)產(chǎn)物分析

超聲破碎后的上清液以親和層析純化，150 mmol/L咪唑洗脫獲得的純化融合蛋白經(jīng)SDSPAGE分析，純度為95%，見圖3。采用BCA蛋白定量法（重組蛋白純化得率=純化后的目的蛋白/上樣前上清液總蛋白×50%）計算得重組蛋白純化得率為22%。

圖3 DsbC-HPV16 L1親和純化后的電泳分析分析結(jié)果

2.3 重組融合蛋白抗原性的免疫印跡法結(jié)果

以重組DsbC蛋白為陰性對照，采用免疫印跡法分析原核系統(tǒng)獲得的重組DsbC-HPV16 L1蛋白的抗原性。以HPV16型陽性血清為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗人IgG為二抗。獲得的重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清產(chǎn)生特異的抗原-抗體反應(yīng)，與重組DsbC蛋白或健康人血清無交叉反應(yīng)。該重組蛋白具有特異的抗原性。見圖4。

圖4 DsbC-HPV16 L1重組蛋白免疫印跡法分析結(jié)果

2.4 DsbC-HPV16 L1融合蛋白免疫反應(yīng)性的ELISA分析結(jié)果

以重組DsbC-HPV16 L1蛋白、重組DsbC蛋白為包被抗原，采用ELISA檢測宮頸癌患者血清特異性HPV16 L1抗體水平。重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性，A450nm均值為0.56，高于健康人血清和PBS陰性對照（A450nm均值分別為0.24和0.21）。重組DsbC蛋白與HPV16型陽性血清、健康人血清和PBS陰性對照的A450nm均值分別為0.31、0.30和0.28，三者之間無差異。見圖5。

圖5 重組DsbC-HPV16 L1蛋白、重組DsbC蛋白與HPV16型陽性血清、健康人血清和PBS陰性對照的ELISA結(jié)果

3 討論

針對HPV的九價疫苗目前已在國內(nèi)上市，接種后可誘導(dǎo)出良好的預(yù)防效果。英國葛蘭素史克公司研發(fā)的二價疫苗Cervarix和美國默克公司研發(fā)的四價疫苗Gardasil在預(yù)防宮頸癌方面有良好的效果[10]，但價格昂貴。通過原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)基因植物等均可獲得重組HPV16 L1蛋白，但原核系統(tǒng)，尤其是以大腸埃希菌作為宿主菌具有代時短、易控制、遺傳背景清楚和廉價等特點(diǎn)，是基因工程工藝首選的宿主菌。重組HPV L1蛋白含有HPV大部分抗原表位，其在多種表達(dá)體系中均能自我組裝成病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）。VLP具有與天然病毒相似的抗原表位和免疫學(xué)特性，以VLP免疫動物，獲得的免疫血清顯示出良好的活性，HPV L1蛋白或其優(yōu)勢表位序列可以成為預(yù)防性疫苗或疫苗的組成部分。由于HPV L1蛋白含有較多的稀有密碼子和較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，國內(nèi)外雖然有成功利用原核系統(tǒng)完整表達(dá)L1蛋白的報道[11]，但因表達(dá)量低、包涵體復(fù)性困難，很難開發(fā)成成規(guī)模化工藝。本研究通過對HPV16 L1蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，同時通過信息學(xué)軟件對其B細(xì)胞表位進(jìn)行綜合預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其C端335～496位氨基酸含有較豐富的B細(xì)胞表位，與王愛萍等[12]預(yù)測的結(jié)果較為一致。對這段序列進(jìn)行密碼子和二級結(jié)構(gòu)的優(yōu)化，通過原核系統(tǒng)獲得了HPV16 L1蛋白C端的高效可溶性融合表達(dá)，重組蛋白的純化得率為22%。血清學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，重組DsbC-HPV16 L1蛋白與HPV16型陽性血清能產(chǎn)生特異的抗原-抗體反應(yīng)，且有較強(qiáng)的免疫反應(yīng)性。目前，篩查宮頸癌患者HPV主要采用PCR技術(shù)，存在著假陽性問題，且取材也有一定的困難，因此經(jīng)典的血清學(xué)方法，如ELISA更為適合。以本研究獲得的重組蛋白為抗原建立檢測HPV16型的ELISA方法，將為宮頸癌患者或類似疾病患者進(jìn)行早期預(yù)防篩查或術(shù)后復(fù)查提供一種簡單、可行的方法。本研究的局限性在于陽性樣本量較小，后期將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)果，以期能研制出新型的檢測試劑盒，造?；颊摺?/p>

綜上所述，本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了HPV16型L1蛋白優(yōu)勢抗原表位的可溶性高表達(dá)，獲得的重組蛋白具有良好的免疫原性和免疫學(xué)活性，這為HPV預(yù)防性疫苗、宮頸癌早期篩查及臨床診斷試劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。