劉 軍，劉 濤，戴碗琴，王藝翔，侯彥強

（上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，上海 201600）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，是人類第九大死因，死亡率在傳染性疾病中排名第一[1]，目前沒有任何疫苗能有效預防成人結核病。我國是全球30個結核病高負擔國家之一，每年新發(fā)結核病病例約90萬例，居全球第3位[2]。我國結核病防治的主要挑戰(zhàn)是耐多藥結核病發(fā)現(xiàn)率低、病原學確診率低、篩查率低、耐藥率高。傳統(tǒng)的涂片和培養(yǎng)方法檢出率低、培養(yǎng)周期長。Xpert MTB/RIF技術可在2 h內檢測MTB及其對利福平的耐藥性[3]。本研究采用Xpert MTB/RIF技術對痰液樣本進行MTB及利福平耐藥性的檢測，評價Xpert MTB/RIF技術在耐多藥結核病快速診斷中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2017年12月—2019年5月上海市松江區(qū)中心醫(yī)院1 573例初診疑似肺結核患者痰液樣本，剔除液體培養(yǎng)污染11例，剩余1 562例用于統(tǒng)計分析。患者男1 112例（71%），年齡（43±18）歲；女450例（29%），年齡（41±16）歲。根據WS 288—2017《肺結核診斷》[4]，肺結核的診斷以病原學（包括細菌學、分子生物學）檢查為主，結合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、輔助檢查及鑒別診斷結果，綜合分析后做出臨床診斷，以病原學和病理學檢查結果為確診依據。

1.2 儀器與試劑

Xpert MTB/RIF GeneXpert系統(tǒng)（美國Cepheid公司），BACTEC MGIT 960系統(tǒng)及配套培養(yǎng)基、添加劑、消化液（美國BD公司），抗酸染液（珠海BASO公司）。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色法 留取初診疑似肺結核患者即時痰、夜間痰和次日晨痰各1份，按《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[5]進行直接涂片抗酸染色鏡檢。

1.3.2 液體培養(yǎng)法 取2 mL痰液經N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化處理，強力旋渦震蕩后室溫靜置，加入磷酸鹽緩沖液，3 000×g離心15 min，棄上清液，沉淀后制備成懸濁液，取0.5 mL接種于培養(yǎng)管，采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進行培養(yǎng)。

1.3.3 Xpert MTB/RIF法 取1 mL黏稠或膿性痰液加入前處理管中，加入2倍處理液，旋緊螺旋蓋，強力旋渦震蕩后室溫靜置，充分液化后用專用無菌吸管吸取0.5 mL，緩慢加入Cartridge單獨反應盒內，采用Xpert MTB/RIF GeneXpert系統(tǒng)自動檢測，約2 h即可直接讀取MTB和利福平耐藥性結果，具體操作參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標準化操作程序及質量保證手冊》[6]。

1.3.4 菌群鑒定和藥物敏感性確認 將液體培養(yǎng)陽性樣本送上海市疾病預防控制中心進行分枝桿菌鑒定（PNB法、TCH法和28 ℃培養(yǎng)）和一線抗結核藥物（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇）敏感性試驗（傳統(tǒng)比例法）。

1.3.5 結果判讀 直接涂片抗酸染色法結果根據抗酸染色量的多少判為4+、3+、2+、1+、條數(shù)和陰性；液體培養(yǎng)法根據BACTEC MGIT 960系統(tǒng)報陽情況，經抗酸染色鏡檢排除雜菌的污染后，再送上海市疾病預防控制中心進行菌群鑒定和藥物敏感性試驗；Xpert MTB/RIF法的結果以高、中、低、極低和未檢出5個量級來表示。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3種方法MTB檢測效能比較

2.1.1 3種方法檢測MTB的敏感性 Xpert MTB/RIF法、液體培養(yǎng)法和直接涂片抗酸染色法檢測MTB的敏感性分別為22.6%（353/1 562）、25.48%（398/1 562）和13.06%（204/1 562）。

2.1.2 3種方法MTB檢測結果一致性 Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法的符合率為93.92%（1 467/1 562），差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.55，P＞0.05）；Xpert MTB/RIF法與直接涂片抗酸染色法的符合率為89.44%（1 397/1 562），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=48.51，P＜0.001）。見表1。

表1 3種方法MTB檢測結果一致性 例

2.1.3 Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法MTB檢測結果比較 1 562例初診疑似肺結核患者中，以液體培養(yǎng)法為標準，Xpert MTB/RIF法檢測204例直接涂片抗酸染色法陽性樣本MTB的敏感性和特異性分別為98.96%（190/192）和50.00%（6/12），與液體培養(yǎng)法比較檢測結果比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.841，P＞0.05）；Xpert MTB/RIF法檢測1 358例直接涂片抗酸染色法陰性樣本MTB的敏感性和特異性分別為66.99%（138/206）和98.35%（1 133/1 152），與液體培養(yǎng)法比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.635，P＜0.05）；Xpert MTB/RIF法檢測1 562例初診疑似肺結核患者痰液樣本MTB的敏感性為82.41%（328/398），特異性為97.85%（1 139/1 164），與液體培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.55，P＞0.05）。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法MTB檢測結果 例

2.2 Xpert MTB/RIF法MTB檢測效能分析

經上海市疾病預防控制中心菌群鑒定確認，188例液體培養(yǎng)陽性樣本中，171例檢出結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）、17例檢出非結核分枝桿菌（non-tuberculousMycobacterium，NTM）。Xpert MTB/RIF法的檢測敏感性為91.23%（156/171）、特異性為88.24%（15/17）、準確性為90.96%（171/188）。Xpert MTB/RIF法與上海市疾病預防控制中心菌群鑒定結果的比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=4.109，P＞0.05）。

2.3 Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性結果

經上海市疾病預防控制中心藥物敏感性試驗確認，171株MTC中，利福平敏感154株、耐藥17株，耐藥率為9.94%；Xpert MTB/RIF法檢測利福平敏感156株、耐藥15株，耐藥率為8.77%。Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥的敏感性為82.35%（14/17）、特異性為99.35%（1/154）。Xpert MTB/RIF法與傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗結果比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.138，P＞0.05）。

3 討論

目前，我國結核病診斷相關檢測方法中，傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色法陽性檢出率低，生物安全要求高，不能及時發(fā)現(xiàn)患者；液體培養(yǎng)法通過添加生長刺激劑，雖然提高了檢測敏感性、縮短了報陽時間，但仍需要2～6周的培養(yǎng)時間，無法滿足臨床診療的需求。隨著分子診斷技術的發(fā)展，Xpert MTB/RIF檢測技術具有較高的敏感性和特異性，在單獨的反應盒內檢測，操作簡單，生物危害度小，2 h內就可以檢測MTB及其對利福平的耐藥性[7]，對于臨床快速診斷和及時治療疾病具有重要意義。

本研究采用Xpert MTB/RIF法、液體培養(yǎng)和直接涂片抗酸染色法檢測1 562例初診疑似肺結核患者痰液樣本中的MTB，敏感性分別為22.6%、25.48%和13.06%，與張青等[8]的研究結論一致，但與劉慧梅等[9]的研究結果比較，3種方法陽性檢出率均較低，可能與選擇的檢測對象不同有關，本研究選取初診疑似肺結核患者為研究對象，而劉慧梅等的研究對象是經過臨床診斷的結核病患者。本研究Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法檢測結果有較高的一致性（χ2=3.55，P＞0.05），敏感性顯著高于直接涂片抗酸染色法（χ2=48.51，P＜0.001），與徐東芳等[10]的研究結論一致。本研究以液體培養(yǎng)法為標準，在204例直接涂片抗酸染色法陽性樣本中，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的敏感性和特異性分別為98.96%和50.00%，與液體培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.841，P＞0.05），與劉亞芹等[11]的研究結論一致；Xpert MTB/RIF法檢測1 358例直接涂片抗酸染色陰性樣本MTB的敏感性和特異性分別為66.99%和98.35%，與液體培養(yǎng)法比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.635，P＜0.05），與劉亞芹等[11]的研究結論不一致，可能與液體培養(yǎng)陽性樣本中存在NTM有關。經上海市疾病預防控制中心菌群鑒定確認，本研究188例液體培養(yǎng)陽性樣本中，17例檢出NTM，Xpert MTB/RIF法只檢出2例，15例檢測結果為陰性，與譚英征等[12]的研究結論一致。與液體培養(yǎng)法比較，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的敏感性為82.41%，特異性為97.85%，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.55，P＞0.05），與趙金云等[13]的研究結論一致。本研究結果表明，對于直接涂片抗酸染色法陽性和陰性樣本，Xpert MTB/RIF法均有著較高的敏感性和特異性。

本研究以上海市疾病預防控制中心菌群鑒定結果為標準，Xpert MTB/RIF法鑒定菌群的敏感性為91.23%、特異性為88.24%、準確性為90.96%，與液體培養(yǎng)法檢測結果比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=4.109，P＞0.05），有較高的一致性，與杜安玲[14]的研究結論一致。

本研究以傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗結果為金標準，Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性的敏感性為82.35%、特異性為99.35%，Xpert MTB/RIF法與傳統(tǒng)比例法比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.138，P＞0.05），有較高的一致性，與張玉華等[15]和宋世森[16]的研究結論一致。其中2例檢測結果不一致，可能與MTB利福平耐藥決定區(qū)域特定rpoB基因突變有關。

結核病的控制與早期篩查發(fā)現(xiàn)、合理規(guī)范治療密切相關，直接涂片抗酸染色法敏感性低、液體培養(yǎng)法耗時長，均難以做到早期發(fā)現(xiàn)、快速診斷。XpertMTB/RIF技術作為世界衛(wèi)生組織認可的一種快速而靈敏的診斷結核病的方法，具有較高的檢測敏感性和特異性，操作簡單，生物危害性低，2 h即可檢測MTB，并篩查利福平耐藥性，對臨床快速診斷和合理、規(guī)范治療具有重要意義。 雖然儀器設備和檢測成本較高，對于耐藥性的篩查也僅限于利福平，不能同時篩查MTB對異煙肼等抗結核藥物的耐藥性，但與直接涂片法和液體培養(yǎng)法比較，在快速診斷和篩查方面邁出了一大步，且操作簡便，硬件設施要求低，適合在基層醫(yī)療機構結核病檢測實驗室大力推廣。