房永贇，盧大儒，沈立松

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

目前，臨床對結(jié)直腸癌的治療難點(diǎn)之一是局部晚期結(jié)直腸癌。為了提高局部晚期結(jié)直腸癌的手術(shù)根治性切除率，并有效降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率，術(shù)前進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的同步放化療，即新輔助治療，已經(jīng)成為這類患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方式。新輔助治療后的評效對于預(yù)測手術(shù)的根治性切除率和制定有效的術(shù)后輔助治療策略都至關(guān)重要。目前常用的評效方法是基于影像學(xué)或術(shù)后組織學(xué)分級來開展的。外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）近年已成為腫瘤分子診斷新的研究熱點(diǎn)，其能夠更靈敏地、更特異地反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)負(fù)荷，從而提示不同治療方式對腫瘤的治療效果。原癌基因（V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，KRAS）在腫瘤細(xì)胞生長過程中起重要調(diào)控作用，正常KRAS可抑制腫瘤細(xì)胞生長，但KRAS突變會持續(xù)刺激腫瘤細(xì)胞生長，打亂生長規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究初步探討ctDNAKRAS突變豐度變化在評價(jià)新輔助治療療效方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取河南省腫瘤醫(yī)院2016年3月—2018年6月住院的結(jié)直腸癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)診斷及影像學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)直腸腺癌；（2）經(jīng)盆腔磁共振成像平掃加增強(qiáng)和/或直腸腔內(nèi)B超提示，腫瘤浸潤深度為T3～T4期和/或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；（3）經(jīng)全面檢查發(fā)現(xiàn)原初轉(zhuǎn)移；（4）患者年齡≥18歲且≤70歲；（5）前期尚未接受任何抗腫瘤治療，未發(fā)現(xiàn)明顯放、化療及手術(shù)禁忌癥，能夠且愿意接受新輔助治療；（6）簽署了知情同意書，并能夠提供新輔助治療前、后外周血。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腫瘤組織經(jīng)分子診斷為KRAS野生型；（2）新輔助治療前外周血ctDNA中未檢測出KRAS突變；（3）因各種原因中斷了新輔助治療及后續(xù)手術(shù)（如患者無法耐受新輔助治療或新輔助治療過程中出現(xiàn)疾病進(jìn)展無法手術(shù)等），無法獲得影像學(xué)或病理學(xué)評估數(shù)據(jù)。

1.2 方法

采用ddPCR KRAS Screening Multiplex Kit（美國Bio-Rad公司）檢測KRAS突變，其可以有效地檢測7種最常見的KRAS突變（包括G12A、G12C、G12D、G12V、G12R、G12S、G13D）和野生型KRAS；采用MagicPure cell-free DNA Kit（北京TransGen Biotech公司）抽提ctNDA，取10 ng ctDNA后，根據(jù)試劑盒說明書的要求配制成聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chian reaction，PCR）反應(yīng)體系，隨后加到微滴發(fā)生卡（美國Bio-Rad公司）中的樣品孔內(nèi)，并在底層的油滴孔中各加入70 μL的微滴生成油，然后在QX200 Droplet Generator（美國Bio-Rad公司）中制備成微滴，并在QX20數(shù)字PCR儀（美國Bio-Rad公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR結(jié)束后將孔板放入QX200 Droplet Reader（美國Bio-Rad公司）中檢測熒光信號，并利用Quanta Soft（美國Bio-Rad公司）判讀并計(jì)算KRAS突變序列在整個PCR反應(yīng)體系中的突變頻率（mutant-allele frequency，MAF）。

分別采集入組患者在接受新輔助治療前1天及完成新輔助治療后1周清晨空腹靜脈血10 mL于促凝管中，1 509×g離心10 min后分離血清待檢，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA與糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）采用Cobas 6000全自動電化學(xué)發(fā)光儀及其配套試劑（瑞士Roche公司）進(jìn)行檢測，當(dāng)日質(zhì)控，以保證結(jié)果的有效性。參考區(qū)間：CEA＜5 ng/mL，CA19-9＜37 U/mL。

1.3 療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

基于胸、腹、盆腔電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）開展新輔助治療的療效評價(jià)，參考羅亞紅等[1]的RECIST標(biāo)準(zhǔn)針對直徑≥20 mm的病灶在新輔助治療前、后影像學(xué)的變化進(jìn)行分類：（1）完全響應(yīng)（complete response，CR），即已知腫瘤病灶完全消失；（2）部分響應(yīng)（partial response，PR），即目標(biāo)病灶最長徑之和減少＞30%；（3）疾病進(jìn)展（progressed disease，PD），即目標(biāo)病灶最長徑之和增加＞20%；（4）疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），即變化介于PD和PR之間。

將入組患者新輔助治療后接受手術(shù)切除的腫瘤組織樣本按照每厘米取材1次切片，交由至少2位病理學(xué)專家獨(dú)立評分。分級主要依據(jù)鏡下殘留腫瘤細(xì)胞和纖維化的比例，參照美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版的腫瘤分級（tumor regression grading，TRG）評分系統(tǒng)[2]，分為4級：（1）完全退縮（TRG0），即鏡下未見腫瘤細(xì)胞；（2）中等退縮（TRG1），即鏡下僅見單個或小灶腫瘤細(xì)胞；（3）輕微退縮（TRG2），即有腫瘤殘留但少于纖維化間質(zhì)；（4）無退縮（TRG3），即無或有少量腫瘤細(xì)胞壞死，存在廣泛的殘留腫瘤。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的疾病特征及新輔助治療療效評價(jià)結(jié)果

入組患者中T3和T4期的患者分別為25例和28例；根據(jù)影像學(xué)評估，有2例（4%）患者為CR，40例（75%）患者為PR，9例（17%）患者為SD，2例（4%）患者為PD。術(shù)后腫瘤組織病理學(xué)評效診斷中TRG0、TRG1、TRG2和TRG3的患者分別為2例（4%）、38例（72%）、7例（13%）和6例（11%）。影像學(xué)評效為CR、PR或PD的患者，均在術(shù)后腫瘤組織病理學(xué)評效診斷中相應(yīng)地被評為TRG0、TRG1或TRG3。見表1。

2.2 入組患者的外周血ctDNA KRAS突變在新輔助治療前、后的變化

入組患者組織檢測為KRAS突變，新輔助治療前外周血微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）檢測ctDNAKRAS突變，檢出率為100%。ddPCR檢出的外周血ctDNAKRAS的MAF在患者接受新輔助治療前、后發(fā)生變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 MAF差值（治療前MAF-治療后MAF）與影像學(xué)評效比較

表1 入組患者的基本特征

以MAF差值為因變量，采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）做MAF差值與影像學(xué)評效的比較分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 MAF差值與病理學(xué)評效多重比較

以MAF差值為因變量，采用LSD做MAF差值與病理學(xué)評效的比較分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 患者血清學(xué)檢測結(jié)果評效

用患者CEA和CA19-9變化差值（均為新輔助治療前-治療后）分別與影像學(xué)和病理學(xué)評效作比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 外周血ctDNA KRAS突變在新輔助治療前、后的變化

表3 MAF差值與影像學(xué)評效多重比較

表4 MAF差值與病理學(xué)評效多重比較

3 討論

對于局部晚期結(jié)直腸癌患者而言，新輔助治療的優(yōu)點(diǎn)為：（1）在腫瘤各級血管未損傷前予以化療，可提高局部化療藥物的濃度；（2）可有效治療臨床或亞臨床的微小轉(zhuǎn)移灶，減少術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；（3）降低臨床分期，縮小原發(fā)病灶，增加手術(shù)機(jī)會；（4）確定腫瘤對化療藥物的敏感性，以指導(dǎo)制定術(shù)后治療計(jì)劃。但新輔助治療也可能因?yàn)槟[瘤的早期進(jìn)展，使患者錯過了手術(shù)的窗口期?？梢娽槍π螺o助治療的療效進(jìn)行及時(shí)而準(zhǔn)確的評估，才能夠充分發(fā)揮新輔助治療的優(yōu)點(diǎn)，正確指導(dǎo)后期的治療[3]。

新輔助治療的評效有多種方法，血清學(xué)指標(biāo)（CEA和CA19-9）被認(rèn)為是可用于判斷病情發(fā)展的重要指標(biāo)之一[4]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)CEA和CA19-9的水平對于新輔助治療較為敏感，疾病得到有效控制的患者（影像學(xué)評效出現(xiàn)CR、PR、SD或病理學(xué)評效出現(xiàn)TRG0、TRG1、TRG2的患者），血清學(xué)指標(biāo)大都發(fā)生了較顯著的變化。這充分說明了血清學(xué)指標(biāo)在評價(jià)治療效果上具有一定的價(jià)值[5]。但是我們還發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)指標(biāo)的變化并不能清晰地對應(yīng)于不同程度的治療效果，如1例患者影像學(xué)評效為PR，病理學(xué)評效為TRG1，而CEA指標(biāo)卻上升了44.4%。血清學(xué)標(biāo)志物的的另一個不足之處在于，有相當(dāng)一部分患者血清標(biāo)志物為陰性，無法用于監(jiān)測。

影像學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和普及使影像學(xué)評效成為最常見的用于指導(dǎo)新輔助治療療效評估的方法[6]。RECIST標(biāo)準(zhǔn)明確了病灶測量方法，并能夠有效地綜合評估多個病灶對于治療的響應(yīng)。本研究中的53例患者中，有42例患者影像學(xué)評效為CR和PR，其中41例（98%，41/42）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF相比新輔助治療有所下降，這4例患者中有2例為CR，39例為PR；僅1例（2%，1/42）出現(xiàn)新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF輕微上升（由2.38%上升到2.41%），該患者的影像學(xué)評效為PR。53例患者中，有11例影像學(xué)評效為SD和PD，其中5例（45%，5/11）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF相比新輔助治療前下降，影像學(xué)評效均為SD，另外6例（55%，6/11）新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF上升，其中4例SD、2例PD，說明影像學(xué)評效并不能顯著區(qū)分SD和PD的情況。

病理學(xué)評效作為一種最直觀、最準(zhǔn)確的腫瘤治療反應(yīng)評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對預(yù)后有重要參考價(jià)值，但其缺點(diǎn)是存在滯后性及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)存在主觀因素[7]。本研究的53例患者中，腫瘤顯著退縮為40例（包含2例TRG0和38例TRG1的患者），其中39例（98%，39/40）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF相比治療前有所下降，僅1例（2%，1/40）患者出現(xiàn)新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF輕微上升（由2.38%上升到2.41%），該患者的退縮評級為TRG1，對于這例患者，需要后期進(jìn)一步隨訪其復(fù)發(fā)情況后進(jìn)行綜合解釋。腫瘤未顯著退縮（包含TRG2和TRG3）的13例患者中，有7例（54%，7/13）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF低于治療前，其中4例為TRG2、3例為TRG3；另外6例（46%，6/13）患者治療后外周血ctDNAKRASMAF升高，其中3例TRG2、3例TRG3。

影像學(xué)評效與金標(biāo)準(zhǔn)的病理組織學(xué)評效總體上高度一致[1，8]。其CR、PR和PD分別有效地對應(yīng)于組織病理學(xué)評效的TRG0、TRG1、TRG3。最大的差別主要來自于影像學(xué)評效提示SD的患者，組織病理學(xué)評效可能包含了TRG1、TRG2、TRG3的可能。這種不一致充分說明了腫瘤大小變化不能完全反映新輔助治療后腫瘤生物學(xué)性質(zhì)變化，解剖學(xué)改變比功能改變要慢。而由于ctDNA來自凋亡腫瘤細(xì)胞的DNA碎片，且半衰期較短，因此相比影像學(xué)更能夠?qū)崟r(shí)反映腫瘤的功能學(xué)變化。

綜上所述，影像學(xué)評效為SD的患者外周血ctDNAKRAS突變的變化趨勢與組織病理學(xué)評效得到的治療效果一致，能有效彌補(bǔ)影像學(xué)評效的不足之處，也能反映出腫瘤對于新輔助治療的響應(yīng)和腫瘤負(fù)荷的變化，區(qū)分SD和PD。因此，在新輔助治療階段監(jiān)測外周血ctDNAKRAS突變，能夠有效地評估腫瘤的治療效果。外周血ctDNAKRAS突變作為一種新的分子評效手段能有效補(bǔ)充傳統(tǒng)的治療評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，協(xié)助臨床制定更精準(zhǔn)的治療策略[9]。由于本研究的病例較少，且選擇的是外周血ctDNAKRAS突變患者，后續(xù)研究應(yīng)該采用更廣泛的突變檢測手段，明確外周血ctDNAKRAS突變在新輔助治療療效中的臨床應(yīng)用價(jià)值。