陳林，楊靖，崔巧榮，徐曉鋒

（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川750021）

0 引 言

由于生活環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)的變化，新生犢牛的機(jī)體容易發(fā)生許多應(yīng)激反應(yīng)。異食癖可導(dǎo)致新生牛犢的代謝紊亂，味覺異常。異食癖犢牛容易咀嚼或食入非營養(yǎng)性物質(zhì)，舔食牛毛、沙子等異物。異物進(jìn)入消化道，導(dǎo)致消化系統(tǒng)紊亂，影響腸黏膜屏障，導(dǎo)致腸道通透性增加，增加犢牛腹瀉率。根據(jù)研究報(bào)告，腸道是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的中樞器官之一[1]。然而，隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，腸道不僅是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，也是體內(nèi)重要的免疫屏障。腸黏膜在維持腸道穩(wěn)定中具有重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能形成腸粘膜免疫系統(tǒng)，保護(hù)機(jī)體健康。腸黏膜屏障由腸黏膜機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、生物屏障和免疫屏障組成[2]；并且腸上皮細(xì)胞和腸緊密連接蛋白在腸黏膜屏障中起重要作用[3-5]。腸緊密連接蛋白與三種主要連接蛋白連接在一起，即腸道緊密連接蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）、閉合蛋白（Claudin）[6-9]。它們之間的緊密聯(lián)系可以防止內(nèi)毒素和其他有害細(xì)菌入侵腸道，維持腸道環(huán)境，保護(hù)機(jī)體健康。如果內(nèi)毒素和有害細(xì)菌進(jìn)入腸道，就會(huì)引起腸道細(xì)菌紊亂，使腸道黏膜屏障受損，腸道通透性增加。研究表明腸道通透性增加可能會(huì)影響氨基酸、蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物和其他營養(yǎng)素的吸收和代謝，容易引發(fā)腹瀉等疾病[10]。ZO-1與維持和調(diào)節(jié)上皮柵欄和屏障功能有關(guān)，還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，維持上皮極性等重要過程。Occludin功能涉及細(xì)胞間黏附、移動(dòng)及通透性，一旦發(fā)生變異、減少和缺失可引起腸上皮細(xì)胞間隙通透性增加，故Occludin和ZO-1常被用來作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和通透性功能的指標(biāo)[11]。研究顯示，緊密連接蛋白的異常表達(dá)，直接影響腸黏膜屏障功能[12]。本試驗(yàn)通過Real-time PCR，探討了異食癖對哺乳期犢牛腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響，為研究犢牛腸黏膜屏障的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物

采用完全隨機(jī)區(qū)組方差分析的試驗(yàn)方法，選擇出生3天，體重相近的犢牛(54.7±5.83 kg)作為研究對象，根據(jù)犢牛舔食牛毛、沙子等癥狀，犢牛表現(xiàn)為被毛粗亂、消瘦，不做任何干預(yù)治療，在犢牛出生后21 d選擇持續(xù)具有異食癖的12頭犢牛做為試驗(yàn)組（異食癖組），健康，無食牛毛、沙子等癥狀的12頭犢牛作為對照組，整個(gè)試驗(yàn)周期持續(xù)到斷奶（56 d）。

1.2 試驗(yàn)日糧及飼養(yǎng)管理

在犢牛出生后及時(shí)消除口腔和鼻孔內(nèi)的黏液，用消毒的剪刀剪斷臍帶并進(jìn)行藥浴處理，擦干被毛，飼喂初乳。出生后1 h內(nèi)飼喂1.5～2.0 kg的初乳，以后隨著食欲的增加而逐漸提高飼喂量，于每日07：00和18：00飼喂混合牛奶，自由飲水和采食開食料，在犢牛能夠站立時(shí)，將其移入犢牛島(1.5 m×3.0 m)進(jìn)行飼養(yǎng)，試驗(yàn)階段對犢牛島進(jìn)行定期消毒處理。其中開食料組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.3 犢牛樣品采集

整個(gè)試驗(yàn)周期持續(xù)到斷奶（56 d），試驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選取5頭進(jìn)行屠宰，將犢牛的十二指腸組織取出，用冷卻后的生理鹽水沖洗腸段中的食糜，沖洗后將腸段剪成約2 cm的小段放入離心管內(nèi)，液氮中過夜，-80℃保存?zhèn)溆谩０驯４娴哪c段組織樣品放在用液氮預(yù)冷的研缽中研磨成白色粉末，取0.1 g研磨好的組織樣品，加入0.9 mL的滅菌生理鹽水，充分搖勻后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，-80℃保存。使用時(shí)避免反復(fù)凍融。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

表1 開食料組成及營養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)） %

采用引物5.0引物設(shè)計(jì)軟件對奶牛腸黏膜6個(gè)基因和β-內(nèi)參基因序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物見表2。

表2 Real-time PCR所用引物

1.5 RNA提取

將采集的樣品移出-80℃，然后用Trizol法提取RNA，步驟如下：

（1）取適量細(xì)胞/取適量組織在液氮中充分研磨，加入1 mL Trizol，震蕩混勻室溫放置5 min；

（2）加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，靜置3 min；

（3）4℃12 000 rpm離心10 min，把上層水相轉(zhuǎn)移到新的管中；

（4）加入等體積異丙醇，混勻，靜置20 min；4℃12 000 rpm離心10 min，去上清；

（5）用1mL 75%DEPC酒精洗滌沉淀；

（6）4℃8 000 rpm離心5 min，棄去液體；

（7）室溫晾干后，加入30μL DEPC處理過的ddH2O水，溶解RNA，鑒定后于-80℃凍存?zhèn)溆茫?/p>

（8）取樣液2 uL于2%的瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 cDNA合成的逆轉(zhuǎn)錄

以1μg總RNA為模板，按照Bestar qPCR RT Kit說明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，總體系為20μL，合成cDNA第一鏈。

1.7 Real-time PCR

用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)，Real-time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μL（表4），PCR反應(yīng)條件：94℃2 min，94℃20 s，58℃20 s，72℃20 s，40循環(huán)。

表3 cDNA合成反應(yīng)體系

表4 Real-time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

利用LIVAK和SCHMITTGEN[13]建立的2-△△Ct方法計(jì)算腸黏膜屏障蛋白和細(xì)胞因子靶向基因的相對表達(dá)量，Ct值表示熒光實(shí)時(shí)定量PCR循環(huán)閾值，即擴(kuò)增過程中每管熒光信號值達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)[14]。計(jì)算得到相對表達(dá)量=2-△△Ct，其中，△Ct=（目的基因Ct-內(nèi)參Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；△△Ct=（待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（若無參照樣品則選擇Ct最大的樣品為參照進(jìn)行計(jì)算）；相對樣品初始模板量=（2-△△Ct）的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。腸道通透性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析采用EXCELL 2003和SAS 8.2完全隨機(jī)分組方差分析，采用SNK最小顯著性方法比較顯著性差異，以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 Real-time PCR的特異性

通過qRT-PCR擴(kuò)增后，由圖1可知目的基因和偏好基因的引物可擴(kuò)增出特異產(chǎn)物，通過離解曲線分析發(fā)現(xiàn)，由圖2可知腸黏膜屏障蛋白mRNA和β-肌動(dòng)蛋白基因的熒光定量產(chǎn)物均為單峰，無其它雜峰，這表明幾乎所有收集到的熒光信號都是用SYBR-GREEN擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，無其它干擾。

2.2 mRNA的表達(dá)水平

通過Real-time PCR方法檢測腸黏膜蛋白mRNA，計(jì)算其相對表達(dá)量，由表5可知異食癖組犢牛腸黏膜蛋白ZO-1相對表達(dá)量顯著低于對照組(P＜0.05)，Occludin和Claudin相對表達(dá)量低于對照組，但差異不顯著(P＞0.05)。由表6可知異食癖組犢牛腸道免疫因子TLR 4相對表達(dá)量顯著低于對照組(P＜0.05)，TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量極顯著高于對照組(P＜0.01)。

3 討 論

3.1 異食癖對哺乳期犢牛腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響

在本試驗(yàn)中異食癖組犢牛腸黏膜蛋白ZO-1相對表達(dá)量顯著低于對照組，Occludin和Claudin相對表達(dá)量低于對照組，但差異不顯著。而ZO-1、Occludin和Claudin是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接的重要蛋白分子，在維持細(xì)胞極性和緊密連接屏障功能方面起著重要作用。腸道黏膜上皮屏障是抵抗腸道中病原微生物和有毒物質(zhì)入侵的第一道防線[15]。緊密連接蛋白（tight junctions，TJ）是構(gòu)成腸道黏膜屏障、決定腸壁通透性的重要蛋白質(zhì)分子，對緊密連接的組成和功能發(fā)揮有很大影響[16]。

ZO-1，也稱為緊密連接蛋白-1，該基因的編碼位于細(xì)胞質(zhì)膜表面的細(xì)胞緊密連接蛋白上。編碼的蛋白質(zhì)可能參與細(xì)胞-細(xì)胞連接處的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。HK-2細(xì)胞中Claudin-2，Occludin和ZO-1的消耗對TER（Transepithelial electrical resistance）和大分子通量有不同的影響，證明了Claudin-2，Occludin和ZO-1的整合對于維持近端小管上皮的功能是必需的[17]。Zhang等[8]研究致病性大腸桿菌感染小鼠的模型，發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞間TJ相關(guān)蛋白Occludin由胞膜區(qū)易位到胞質(zhì)內(nèi)，同時(shí)伴有腸上皮細(xì)胞旁路滲透性增加，推測Occludin的分布異?？赡軐?dǎo)致腸上皮屏障功能受損，進(jìn)而參與腹瀉的發(fā)生、發(fā)展過程。缺乏緊密連接蛋白Claudin的鼠模型，升高了細(xì)胞旁路的溶質(zhì)流通量，促發(fā)了腸道的炎癥發(fā)生[18]，這些研究表明腸道緊密連接蛋白與腸道滲透性，腸道屏障功能關(guān)系密切。在本試驗(yàn)中異食癖組犢牛腸黏膜蛋白ZO-1相對表達(dá)量顯著低于對照組，Occludin和Claudin相對表達(dá)量低于對照組，表明患有異食癖的哺乳期犢牛破壞了腸道的緊密連接蛋白的功能，造成了腸道黏膜屏障受損，進(jìn)而使異食癖犢牛腸道通透性增加。

細(xì)胞外Ca2+濃度對TJ的影響與PKC信號通路有關(guān)。低鈣條件下培養(yǎng)MDCK(madindarbycaninekindy，MDCK)細(xì)胞出現(xiàn)TJ破壞現(xiàn)象，加入PKC激動(dòng)劑可觀測到Occludin蛋白的磷酸化，并向TJ處移位，重建TJ。此作用可被PKC的抑制劑所抑制[19]。Kale等[20]發(fā)現(xiàn)Occludin的酪氨酸磷酸化降低了其結(jié)合ZO-1，ZO-2和ZO-3的能力，從而引起TJ的斷裂。與細(xì)胞外Ca2+相比，細(xì)胞內(nèi)Ca2+主要改變ZO-1與肌動(dòng)蛋白的結(jié)合，并改變Occludin在細(xì)胞內(nèi)的位置。低氧條件下細(xì)胞內(nèi)Ca2+的短暫升高，鈣調(diào)蛋白依賴的激酶等細(xì)胞外信號相關(guān)激酶的激活，引發(fā)級聯(lián)反應(yīng)，從而使Occludin蛋白等TJ相關(guān)蛋白在mRNA水平及蛋白表達(dá)層面上產(chǎn)生改變，最終引起細(xì)胞屏障功能破壞[21]。周景明等[22]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)常量礦物質(zhì)元素如鈣、磷、鈉、鉀、硫以及微量元素如鋅、鈷、鐵等供給量不足，或各種礦物元素彼此之間的比例失衡時(shí)，奶牛就會(huì)舔食泥沙、墻壁、飼槽以及啃食金屬，長期喂給大量精料或酸性飼料過多，都可引起體內(nèi)堿的消耗過多，而致鈣、磷比例失調(diào)，也會(huì)形成異食癖。眭丹等[23]研究發(fā)現(xiàn)銅、鋅、硒缺乏會(huì)引起舍飼灘羊異食癖的發(fā)生。目前關(guān)于動(dòng)物異食癖的形成機(jī)理還不十分清楚，本研究發(fā)現(xiàn)異食癖犢牛腸黏膜蛋白ZO-1相對表達(dá)量顯著低于對照組犢牛，Occludin和Claudin相對表達(dá)量低于對照組，但差異不顯著，異食癖犢牛腸道通透性增加，對犢牛健康尤其腸道健康存在重要影響。

圖1 目標(biāo)基因和偏好基因的擴(kuò)增圖

表5 腸道黏膜緊密連接蛋白mRNA相對表達(dá)量

表6 腸道免疫因子mRNA相對表達(dá)量

3.2 異食癖對哺乳期犢牛腸道免疫因子表達(dá)的影響

圖2 目標(biāo)基因與偏好基因的解離曲線

在本試驗(yàn)中異食癖組犢牛腸道免疫因子TLR 4相對表達(dá)量顯著低于對照組。在腸道中識別非特異的微生物抗原是通過類型識別受體如Toll樣受體家族實(shí)現(xiàn)的，Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)是一類天然免疫受體，是先天免疫系統(tǒng)重要的組成部分[24]，TLR 4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白，當(dāng)TLR 4與相應(yīng)配體結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到TLR區(qū)域，然后進(jìn)一步激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶信號通路，從而促進(jìn)各種炎性細(xì)胞因子基因表達(dá)的激活。TLR 4也是介導(dǎo)內(nèi)毒素/脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)應(yīng)答的主要受體[25]。Shi等[26]發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸可以激活脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的TLR 4受體，TLR 4缺乏的細(xì)胞則游離脂肪酸的炎性作用被阻斷，TLR 4是營養(yǎng)脂類和炎癥之間的分子聯(lián)系，參與調(diào)節(jié)能量平衡和先天免疫系統(tǒng)，以應(yīng)對營養(yǎng)環(huán)境的變化。有研究發(fā)現(xiàn)TLR 4缺陷破壞了腸道微生物群，降低了小鼠對肺炎鏈球菌耐藥性[27]。而異食癖組犢牛腸道免疫因子TLR 4相對表達(dá)量顯著低于對照組，表明患有異食癖的哺乳期犢牛腸道免疫機(jī)能下降。

本試驗(yàn)中異食癖組犢牛腸道免疫因子TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量極顯著高于對照組，異食癖犢牛發(fā)生腸黏膜炎癥損傷時(shí)，炎癥早期最先分泌的促炎細(xì)胞因子主要是IL-1β和TNF-α，這些細(xì)胞因子可以啟動(dòng)其他細(xì)胞因子的釋放[28]。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)最早、最重要的炎性介質(zhì)。TNF-α可通過多種方式促進(jìn)系膜細(xì)胞的增殖與分化，并促使系膜細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子。TNF-α是參與全身性炎癥的細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白（細(xì)胞因子），并且是構(gòu)成急性期反應(yīng)的細(xì)胞因子之一。它主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，TNF的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞。研究表明TNF-α可能通過激活NF-κB，增加肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinae，MLCK）的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，MLCK又激活MLC，引起肌動(dòng)和肌球蛋白收縮，進(jìn)而增加Occludin等跨膜蛋白的內(nèi)吞作用[29]，減少其在TJ上的定位，導(dǎo)致屏障功能失調(diào)[30]。本試驗(yàn)中異食癖組犢牛腸道免疫因子TNF-α相對表達(dá)量極顯著高于對照組，說明患有異食癖的哺乳期犢牛腸道通透性增加，降低了機(jī)體免疫能力。這與胡丹丹等[31]研究一致。

TNF-α還會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑谷胱甘肽（GSH）[32]。轉(zhuǎn)基因小鼠中TNF-α的過度表達(dá)通過消耗總細(xì)胞谷胱甘肽水平誘導(dǎo)氧化還原狀態(tài)和谷胱甘肽調(diào)節(jié)酶的差異變化[33]。體外研究還證明TNF-α消耗細(xì)胞GSH水平。用TNF-α處理人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞降低了細(xì)胞的GSH水平[34]，這種谷胱甘肽的消耗增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞對氧中毒的易感性[35]。胡丹丹等[31]研究表明患有異食癖的犢?？寡趸芰^弱。本試驗(yàn)中異食癖犢牛腸道免疫因子TNF-α相對表達(dá)量極顯著高于對照組，表明異食癖犢牛TNF-α消耗了細(xì)胞內(nèi)的GSH，患有異食癖的哺乳期犢牛抗氧化能力較弱。

TNF-α可促進(jìn)IL-1β的分泌與釋放，參與機(jī)體內(nèi)的炎癥反應(yīng)和發(fā)熱反應(yīng)[36]。IL-1β是白介素1細(xì)胞因子家族的成員。該細(xì)胞因子由活化的巨噬細(xì)胞作為前蛋白產(chǎn)生，其通過半胱天冬酶1（CASP1/ICE）蛋白水解加工成其活性形式。該細(xì)胞因子是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。IL-1β的產(chǎn)生增加引起許多不同的自身炎癥綜合征，最明顯的是由于炎性體受體NLRP3的突變引起IL-1β的加工而被稱為Cryopyrin相關(guān)的周期綜合征（CAPS）的單基因條件[37]。AlSadi等[19]發(fā)現(xiàn)IL-1β導(dǎo)致腸上皮TJ通透性增加，IL-1β可能通過降解I-κB，激活了NF-κB，進(jìn)而抑制Occludin蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的活性，導(dǎo)致Occludin的mRNA表達(dá)量下降，破壞了TJ的功能。本試驗(yàn)中異食癖組犢牛腸道免疫因子IL-1β相對表達(dá)量極顯著高于對照組，表明患有異食癖的哺乳期犢牛引起了腸道的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而造成了機(jī)體免疫力下降。

4 結(jié) 論

患有異食癖的哺乳期犢牛腸黏膜蛋白ZO-1相對表達(dá)量顯著低于對照組，腸道通透性增加?；加挟愂绸钡牟溉槠跔倥Ｄc道免疫因子TLR 4相對表達(dá)量顯著低于對照組，腸道免疫因子TNF-α和IL-1β相對表達(dá)量極顯著高于對照組，異食癖犢牛腸道免疫因子表達(dá)下調(diào)，腸道黏膜炎癥因子表達(dá)上調(diào)，腸道抗氧化能力減弱。