梅邇藍(lán)，張猛，賈星，雙全，代麗霞，龐靜，包秋華

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

0 引 言

近年來由于自然環(huán)境的變化，有些微生物已受到環(huán)境的影響。為應(yīng)對(duì)一些不良環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)部會(huì)發(fā)生很多改變來維持其生存能力，其中一個(gè)重要的變化是細(xì)胞通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸來改變細(xì)胞膜流動(dòng)性[1]。有些細(xì)菌隨著逆境生存環(huán)境的改變會(huì)使其進(jìn)入VBNC狀態(tài)（Viable but non-culturable，活的非可培養(yǎng)態(tài)）[2-4]。

益生乳酸菌以活性狀態(tài)進(jìn)入人體腸道才能發(fā)揮益生作用，食用的乳酸菌在經(jīng)過胃等消化道前端時(shí)，部分會(huì)因胃液的低pH、胃消化酶、膽汁鹽[5]等因素而被殺死，從而導(dǎo)致乳酸菌存活率降低，到達(dá)腸道的活菌數(shù)量減少。因此，乳酸菌要在人體內(nèi)發(fā)揮益生功效，必須對(duì)胃酸和胃蛋白酶具有一定的耐受性[6]。干酪乳桿菌張（Lactobacillus casei Zhang，簡稱Lb.casei Zhang）是從錫林郭勒盟正藍(lán)旗草原上自然發(fā)酵酸馬奶中分離篩選出的一株具有益生菌特性的乳酸菌，是經(jīng)試驗(yàn)證明具有耐酸耐膽鹽、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種益生特性的干酪乳桿菌，且已市場化應(yīng)用[7]。

在本課題中，以Lb.casei Zhang為研究對(duì)象，通過對(duì)其在模擬人工胃液的逆境條件下進(jìn)行脅迫處理，用Bligh&Dyer法提取脂肪酸，然后用氣相色譜儀檢測分析Lb.casei Zhang在模擬人工胃液條件下不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞膜脂肪酸變化，以初步解析其逆境生存機(jī)理。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

菌株：本實(shí)驗(yàn)所用的Lb.casei Zhang由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)“乳品生物技術(shù)與工程”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室菌種資源庫保存并提供。

試劑：液體MRS及固體MRS均購自英國Oxoid公司，胃蛋白酶購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司，37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Supelco 47885-U)購于Supelco公司，HCl、NaCl、生理鹽水、氯仿-甲醇溶液、氯仿、去離子水、甲醇鈉-甲醇、正己烷。

1.2 儀器

恒溫培養(yǎng)箱DHP-9272，上海恒科有限公司；高速離心機(jī)HC-2518，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；氮吹儀EYELA MG-2200，日本；氣相色譜儀6850型，美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

將Lb.casei Zhang接入MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃靜置培養(yǎng)18～24 h，按2%接種量活化三代，將第三代對(duì)數(shù)生長末期的菌體通過革蘭氏和吖啶橙染色進(jìn)行形態(tài)觀察和活性測定。

1.3.2 人工胃液作用下Lb.casei Zhang的脅迫

活化的菌體5 000 g離心5 min，倒掉培養(yǎng)基，加入適量生理鹽水洗菌，收集菌泥，加入pH為2.5、3、3.5的3種人工胃液[8]中，37℃靜置脅迫。

1.3.3 人工胃液作用下Lb.casei Zhang活菌數(shù)量變化

利用傾注平板計(jì)數(shù)法檢測Lb.casei Zhang在3種不同pH人工胃液作用下0、2、4 h的活菌數(shù)量，37℃培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.4 膜脂肪酸的提取及甲酯化

對(duì)3種不同pH人工胃液處理的Lb.casei Zhang在0、1、2、3、4 h進(jìn)行取樣，采用Bligh&Dyer法提取膜脂肪酸。0.5 g菌泥用生理鹽水洗滌離心后加入1.9 mL氯仿-甲醇溶液震蕩，再加入0.625 mL氯仿及無菌去離子水，震蕩后進(jìn)行離心，吸取下層液相轉(zhuǎn)移到新的離心管里，氮吹儀吹干。接著在樣品中加入1 mL甲醇鈉-甲醇溶液（1 mol/L），冰浴條件下振搖進(jìn)行甲酯化，加入0.6 mL正己烷萃取脂肪酸的甲酯，離心后吸取上層液相進(jìn)行氣相色譜分析。

1.3.5 脂肪酸組分和含量的測定

先用37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Supelco 47885-U)定標(biāo)，然后通過氣相色譜法檢測Lb.casei Zhang在不同pH人工胃液條件不同時(shí)間的細(xì)胞膜脂肪酸組分和含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

待測樣本的脂肪酸色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行比較，如果Lb.casei Zhang的脂肪酸保留時(shí)間與標(biāo)品保留時(shí)間的差值＜0.1 min，則可以確定為同一種脂肪酸，從而定性檢測Lb.casei Zhang中的脂肪酸成分。用面積歸一化法(以峰值面積的百分比表示)確定各種脂肪酸的百分含量[9]。上述所有數(shù)據(jù)均采用SPSS等軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lb.casei Zhang的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將活化第三代的Lb.casei Zhang進(jìn)行革蘭氏染色和吖啶橙染色，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 Lb.casei Zhang革蘭氏染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

圖2 Lb.casei Zhang吖啶橙染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過圖1、圖2可以看出，Lb.casei Zhang為革蘭氏陽性桿菌，大小形態(tài)均一，綠色活菌數(shù)量多，活力較好，證明未被污染，可以用于下述實(shí)驗(yàn)。

2.2 Lb.casei Zhang活菌數(shù)變化結(jié)果

Lb.casei Zhang經(jīng)人工胃液處理后，不同條件不同時(shí)間的活菌數(shù)變化結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示在模擬人工胃液脅迫下，p H為2.5、3、3.5時(shí)活菌數(shù)量均隨時(shí)間增加而減少，pH為2.5時(shí)在0～2 h活菌數(shù)量下降最快，而從第2小時(shí)開始，細(xì)菌存活率隨時(shí)間延長下降速率減慢，但p H為3.5時(shí)4 h處活菌數(shù)仍然較高。

2.3 Lb.casei Zhang在模擬人工胃液條件下膜脂肪酸組分和含量的檢測

首先通過氣相色譜法對(duì)37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品定標(biāo)，得到了能夠檢測37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的最佳氣相檢測條件，接著通過氣相色譜法檢測Lb.casei Zhang在模擬不同p H的人工胃液中，不同時(shí)間點(diǎn)處理?xiàng)l件下的脂肪酸的變化。部分脂肪酸峰圖結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 Lb.casei Zhang在人工胃液pH 2.5、0 h脂肪酸氣相色譜圖

圖5 Lb.casei Zhang在人工胃液pH 2.5、2 h脂肪酸氣相色譜圖

從氣相色譜圖也可以看出某一種脂肪酸含量的顯著變化。比如從圖4、圖5可以看出，Lb.casei Zhang在模擬pH 2.5的人工胃液2 h時(shí)肉豆蔻酸（C14∶0）的峰高（出峰時(shí)間14.392 min）與0 h（出峰時(shí)間14.404 min）相比要低。

分析Lb.casei Zhang在模擬人工胃液條件下不同時(shí)間細(xì)胞膜脂肪酸構(gòu)成，主要由7種脂肪酸組成，見表1（由于其他脂肪酸相對(duì)百分含量較少從而不進(jìn)行具體分析），分別是肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、反油酸（C18∶1n9t）、反亞油酸（C18∶2n6t）、亞油酸（C18：2）、亞麻酸（C18∶3）。

表1 Lb.casei Zhang的脂肪酸種類

2.4 模擬人工胃液條件下Lb.casei Zhang細(xì)胞膜脂肪酸的變化分析

分析Lb.casei Zhang在模擬人工胃液下不同時(shí)間點(diǎn)的脂肪酸變化，以相對(duì)百分含量表示，結(jié)果見表2。

由表2可見，Lb.casei Zhang在模擬人工胃液4 h內(nèi)細(xì)胞膜中含量相對(duì)較高的7種脂肪酸變化均顯著，其中棕櫚酸（C16：0）是Lb.casei Zhang細(xì)胞膜的主要飽和脂肪酸，變化范圍在(21.48±0.51)%～(35.31±0.51)%，其次是肉豆蔻酸（C14：0）；亞油酸（C18：2）是主要的不飽和脂肪酸，變化范圍在(22.62±0.29)%～(39.47±0.79)%。

下一步對(duì)模擬不同p H人工胃液下Lb.casei Zhang的各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸脂肪酸相對(duì)百分含量變化。

2.4.1 模擬人工胃液pH 2.5時(shí)Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

對(duì)Lb.casei Zhang在人工胃液p H 2.5時(shí)各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果見圖6、圖7。

表2 Lb.casei Zhang模擬人工胃液下脂肪酸變化

圖6 pH2.5時(shí)脂肪酸隨時(shí)間相對(duì)百分含量變化

圖7 pH2.5時(shí)總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸脂肪酸相對(duì)百分含量對(duì)比

從圖6、圖7可以看出，Lb.casei Zhang在pH 2.5時(shí)，反亞油酸（C18：2n6t）和亞油酸（C18：2）這兩種脂肪酸在0～2 h內(nèi)均出現(xiàn)了較大幅度的增加，從第2 h開始脂肪酸百分含量開始減少；反油酸（C18：1n9t）在0～1 h出現(xiàn)略微增加，然后一直降低；其余4種脂肪酸在0～2 h均出現(xiàn)下降的趨勢。不飽和脂肪酸含量均高于飽和脂肪酸含量，而且在0～2 h總不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量逐漸增加，在3～4 h不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量較2 h時(shí)出現(xiàn)略微下降，但仍高于飽和脂肪酸含量。這一結(jié)論與Guerzoni的研究結(jié)果相似[10]，他將瑞士乳桿菌暴露于不利于其生長的溫度、酸堿度等條件中，發(fā)現(xiàn)不飽和脂肪酸在細(xì)胞膜中的比例增加。

2.4.2 模擬人工胃液pH 3時(shí)Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

對(duì)Lb.casei Zhang在人工胃液p H 3時(shí)各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了對(duì)比分析結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 pH3時(shí)脂肪酸隨時(shí)間相對(duì)百分含量變化

圖9 pH3時(shí)總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸脂肪酸相對(duì)百分含量對(duì)比

從圖8、圖9可以看出，Lb.casei Zhang在p H 3時(shí)反亞油酸（C18∶2n6t）和亞油酸（C18∶2）這兩種脂肪酸在0～3 h內(nèi)均出現(xiàn)了較大幅度的減少，從第3 h開始脂肪酸百分含量開始出現(xiàn)增加；而反油酸（C18∶1n9t）、肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、亞麻酸（C18∶3）在0～1 h出現(xiàn)增加的趨勢，從第3 h開始各脂肪酸相對(duì)百分含量均出現(xiàn)下降。此外，不飽和脂肪酸含量均高于飽和脂肪酸含量，而且總不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量在0～3 h發(fā)生波動(dòng)，在第4 h出現(xiàn)顯著增加，而總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量在0～3 h出現(xiàn)相反波動(dòng)，在4 h時(shí)含量顯著下降。

2.4.3 模擬人工胃液pH 3.5時(shí)Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

對(duì)Lb.casei Zhang在人工胃液p H 3.5時(shí)各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果見圖10、圖11。

圖10 pH3.5時(shí)脂肪酸隨時(shí)間相對(duì)百分含量變化

圖11 pH3.5時(shí)總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸脂肪酸相對(duì)百分含量對(duì)比

從圖10、圖11可以看出，Lb.casei Zhang在pH 3.5時(shí)，亞油酸（C18∶2）、肉豆蔻酸（C14∶0）反油酸（C18∶1n9t）這三種脂肪酸在0～1 h內(nèi)均出現(xiàn)了減少，從第2 h開始亞油酸（C18∶2）的相對(duì)百分含量開始出現(xiàn)較大幅度的增加；而反亞油酸（C18∶2n6t）和棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、亞麻酸（C18∶3）在0～1 h出現(xiàn)增加的趨勢，在1 h以后相對(duì)百分含量開始出現(xiàn)減少，但是變化幅度小、不明顯。pH 3.5時(shí)不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量仍高于飽和脂肪酸含量，而且總不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量在0～4 h總體趨勢為先減少后增加，總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量在0～4 h總體趨勢先增加后減少，這表明脅迫后期Lb.casei Zhang不飽和脂肪酸的增加與總飽和脂肪酸的減少在一定程度上調(diào)節(jié)了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，使細(xì)胞更好的適應(yīng)不良環(huán)境。

3 討 論

乳酸菌是以口服的方式進(jìn)入人體或動(dòng)物消化道內(nèi)，菌株需具有抵抗較低p H及胃蛋白酶的能力，才能有效的在胃腸道發(fā)揮作用。胃液會(huì)嚴(yán)重影響乳酸菌的活性[11]，韓墨[12]模擬人體消化液，篩選了對(duì)人體胃腸液抵抗性較高的菌株，為確保菌株在腸道內(nèi)的存活和定植提供了基本保障。余芳[13]對(duì)10株乳酸菌進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們均具有一定的產(chǎn)酸、耐受人工胃腸液的能力，其中LCR這株菌在人工胃液培育3 h后的存活率較高，該試驗(yàn)對(duì)乳酸菌進(jìn)入消化道發(fā)揮作用的研究具有重要意義。本試驗(yàn)對(duì)Lb.casei Zhang在人工胃液條件處理，菌株活菌數(shù)量雖然持續(xù)下降，但在2～4 h下降趨于平緩，推測是因?yàn)轶w內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激機(jī)制，使Lb.casei Zhang對(duì)人工胃液產(chǎn)生耐受性。柏建玲和吳清平[14]等人模擬人體胃液實(shí)際情況，利用人工胃液進(jìn)行耐胃液試驗(yàn)研究，使菌株的耐胃液能力得到一定程度的提高[15]，這和本試驗(yàn)用菌株Lb.casei Zhang有一定相似之處，在逆境條件會(huì)產(chǎn)生一系列自我保護(hù)系統(tǒng)，來抵御不利環(huán)境造成的傷害。

逆境條件下細(xì)胞膜脂肪酸確實(shí)會(huì)發(fā)生一定程度的變化[16]，吳重德[17]研究發(fā)現(xiàn)酸脅迫會(huì)引起細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度的增加，此外還引起細(xì)胞膜完整性的變化，酸脅迫條件下，進(jìn)化菌株能夠更好地保持膜的完整性，從而有效地減輕了酸脅迫對(duì)細(xì)胞造成的損傷。本試驗(yàn)證明，Lb.casei Zhang在模擬人工胃液條件下，不同p H時(shí)細(xì)胞內(nèi)總不飽和脂肪酸比總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量高，猜測細(xì)菌在受到外界環(huán)境劇烈改變時(shí)，細(xì)胞膜首先受到環(huán)境刺激，表現(xiàn)在細(xì)胞膜脂肪酸組分及含量發(fā)生改變，以此來減小對(duì)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的傷害。Wang Yu[18]等認(rèn)為調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成是乳酸菌細(xì)胞在逆境脅迫環(huán)境下自我保護(hù)的首選措施。李揚(yáng)等人[19]對(duì)德氏乳桿菌保加利亞亞種分別在pH值為6.0、5.0和5.5的條件下培養(yǎng)，接著對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸進(jìn)行提取和測定，發(fā)現(xiàn)在不同p H下細(xì)胞膜脂肪酸的含量不同，但其含量與p H無線性關(guān)系，這可能與菌體細(xì)胞膜在逆境脅迫條件下的自我調(diào)節(jié)有關(guān)，本試驗(yàn)中，Lb.casei Zhang在pH為2.5、3、3.5的人工胃液脅迫處理，細(xì)胞膜總飽和脂肪酸與總不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量均發(fā)生顯著變化，推測這可能是菌體為抵抗不良環(huán)境所產(chǎn)生的應(yīng)激機(jī)制。趙小茜和魏旭丹等人[20]研究了乳酸菌的耐酸機(jī)制，其中之一就是改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌在受到酸脅迫時(shí)細(xì)胞膜上的結(jié)合蛋白酶會(huì)增加，從而促使ATP的合成和水解產(chǎn)生能量，將胞內(nèi)的H+泵出胞外，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。此外研究發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌生存溫度降低到5℃，這種生物體進(jìn)入活的但不可培養(yǎng)的(VBNC)狀態(tài)，而且細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化意味著細(xì)胞維持膜流動(dòng)性能力發(fā)生了變化，可能是該生物進(jìn)入VBNC狀態(tài)的一個(gè)促成因素[21]。在我們課題組的研究中，包秋華證實(shí)Lb.casei Zhang在低溫條件下可以進(jìn)入VBNC態(tài)[22]，所以分析具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生乳酸菌Lb.casei Zhang逆境生存機(jī)理將具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究通過模擬人工胃液對(duì)Lb.casei Zhang進(jìn)行逆境脅迫，檢測了其脂肪酸組分和含量的變化，并對(duì)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了研究。得到以下結(jié)論：在模擬人工胃液環(huán)境下膜脂肪酸主要由肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、反油酸（C18∶1n9t）、反亞油酸（C18∶2n6t）、亞油酸（C18∶2）、亞麻酸（C18∶3）組成，這7種脂肪酸占總細(xì)胞膜脂肪酸的比例最大。

從相對(duì)百分含量上看，不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量減少，Lb.casei Zhang為應(yīng)對(duì)不良環(huán)境變化，通過增加細(xì)胞膜流動(dòng)性來改善細(xì)胞活性，這對(duì)初步解析Lb.casei Zhang逆境生存機(jī)理具有重要意義。