鄧祖麗穎，劉雨豐，馬寧寧，陳 陸

(1.鄭州幼兒師范高等專科學(xué)校，河南 鄭州450000；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州450000)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的病原。PCV2主要侵害2～8周齡斷奶仔豬，死亡率高達(dá)50%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV2主要經(jīng)口腔、呼吸道等黏膜侵入機(jī)體并侵害免疫系統(tǒng)，能直接或間接導(dǎo)致免疫抑制[1-2]。因此，PCV2疫苗設(shè)計(jì)應(yīng)側(cè)重于誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫[3]。圓環(huán)病毒增殖能力較低，常規(guī)滅活疫苗抗原含量不足，免疫反應(yīng)緩慢而微弱，且易在動(dòng)物體內(nèi)引起過(guò)敏反應(yīng)，且無(wú)法有效誘導(dǎo)病原體特異性黏膜免疫應(yīng)答[4-5]。CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子水平的變化趨勢(shì)可以間接反映感染豬的免疫能力，尤其以IFN-γ參與的Th1型細(xì)胞免疫在抗病毒免疫防御中最為重要。腺病毒載體攜帶抗原種類多，抗原遞呈能力強(qiáng)，且產(chǎn)生的免疫力持久、安全性高，適合作為病毒疫苗載體[6]。

Cap蛋白是PCV2的主要免疫原蛋白，含有主要保護(hù)性抗原表位,是制備PCV2疫苗的理想靶抗原。目前，各國(guó)學(xué)者已研究出有效的疫苗，如重組亞單位疫苗、滅活疫苗和DNA疫苗等[7-9]，但許多研究成果仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。新型基因工程疫苗的價(jià)格普遍較高，且其基因改造是否會(huì)帶來(lái)潛在危害還不清楚[10]。因此，研制高效廉價(jià)的新型疫苗尤為重要[11-12]，是增強(qiáng)免疫效果和降低經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。研究表明，表達(dá)PCV2 Cap蛋白的重組腺病毒可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體[13-16]。鑒于此，在前期構(gòu)建PCV2 Cap蛋白主要抗原表位重組復(fù)制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)的基礎(chǔ)上，將其經(jīng)滴鼻、口服和肌內(nèi)3種免疫途徑免疫小鼠，評(píng)價(jià)其所誘導(dǎo)的全身性和局部黏膜免疫應(yīng)答效果，旨在為研發(fā)PCV2新型黏膜免疫疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

PCV2 Cap蛋白主要表位重組復(fù)制缺陷型腺病毒(rAd/Cap/518)和原核表達(dá)的PCV2 Cap蛋白由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、表達(dá)和保存；腺病毒載體(wild-rAd)由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)姜平教授惠贈(zèng)；PCV2 YY株由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室分離、保存；DNA提取試劑盒、SYBR Premix ExTaq酶等均購(gòu)自TaKaRa公司；FITC-CD3、PE-CD4和PerCP-CD8a單克隆抗體等均購(gòu)自Biolegend公司；HRP標(biāo)記兔抗小鼠IgG購(gòu)自博奧森公司；HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgA購(gòu)自Bethyl公司；商品化細(xì)胞因子ELISA試劑盒購(gòu)自CST公司。

供試Balb/c小鼠由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank公布的PCV2Cap基因序列(登錄號(hào)：KU960941.1)，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitative PCR ,qPCR)引物。上、下游引物序列分別為5′-TATCAATCTAACCACAGTC-3′和5′-ATGGCGGGAGGAGTAGTT-3′。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，擴(kuò)增目的基因長(zhǎng)276 bp。

1.2.2 免疫和攻毒試驗(yàn) 將80只6～8周齡的雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分成4組，每組20只。rAd/Cap/518通過(guò)滴鼻(rAd/Cap/518 i.n)、肌內(nèi)注射(rAd/Cap/518 i.m)和口服免疫(rAd/Cap/518 oral)，每只小鼠10lgTCID50，設(shè)空腺病毒(wild-rAd)滴鼻免疫(wild-rAd i.n)為對(duì)照。首免后14 d以相同劑量和方法加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后14 d，每組取5只小鼠滴鼻攻毒3×105TCID50PCV2 YY株。

1.2.3 間接ELISA檢測(cè)抗PCV2特異性IgG和 IgA抗體 采集首免后14、21、28、35、42 d小鼠血清樣品及首免后14、21、28、35 d唾液、肺部灌洗液、腸道灌洗液。用間接ELISA分別檢測(cè)PCV2特異性IgG和IgA抗體水平[17]。

1.2.4 T細(xì)胞亞群分析及細(xì)胞因子檢測(cè) 分離首免后14、21、28 d小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，用含10%犢牛血清的RPMI 1640稀釋至1×107個(gè)/mL，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔。每孔加入PCV2 Cap蛋白1 μg，5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，PBS液洗2次，分別加入FITC-CD3、PE-CD4和PerCP-CD8a單克隆抗體，避光孵育30 min。洗細(xì)胞2次后,用FACS Calibur流式細(xì)胞儀分析CD3+T細(xì)胞、CD3+CD4+T細(xì)胞及CD3+CD8+T細(xì)胞亞群百分比。商品化細(xì)胞因子ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ、IL-4的分泌水平[18]。

1.2.5 qPCR檢測(cè)病毒載量 PCV2 YY株攻毒后14 d，收集小鼠淋巴結(jié)、脾臟和肺組織。使用DNA提取試劑盒提取核酸，通過(guò)qPCR法檢測(cè)PCV2病毒載量[19]。qPCR擴(kuò)增體系(20 μL)：上、下游引物各0.8 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，樣品DNA模板500 ng，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。qPCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用GraphPad Prism對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果以數(shù)值平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫小鼠血清IgG和唾液、肺部及腸道灌洗液IgA抗體

為檢測(cè)全身體液免疫應(yīng)答，采用間接ELISA方法測(cè)定免疫小鼠后14～42 d抗PCV2特異性IgG和 IgA抗體水平(圖1)。免疫后21～42 d，rAd/Cap/518經(jīng)肌內(nèi)注射小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清IgG抗體水平顯著高于wild-rAd對(duì)照組及滴鼻和口服免疫組(圖1A)。rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻免疫后21～28 d以及經(jīng)口服免疫后35～42 d小鼠唾液誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性IgA抗體水平均顯著高于對(duì)照組(圖1B)。免疫后21～35 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻免疫誘導(dǎo)肺部灌洗液中產(chǎn)生的特異性IgA抗體水平顯著高于對(duì)照組(圖1C)。免疫后21～35 d，rAd/Cap/518經(jīng)口服途徑免疫后誘導(dǎo)腸腔灌洗液中產(chǎn)生的特異性IgA抗體水平顯著高于對(duì)照組(圖1D)。

A:rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠血清中PCV2特異性IgG抗體動(dòng)態(tài)變化；B—D:分別為rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠唾液、肺部灌洗液和腸道灌洗液中特異性IgA抗體動(dòng)態(tài)變化。不同字母表示同一時(shí)間不同處理間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 免疫小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群分析

由表1可知，在14、21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻、肌內(nèi)和口服3種途徑免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD3+T細(xì)胞百分率為46.60%～55.65%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。在21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的 CD3+CD4+T細(xì)胞百分率為34.43%～37.29%；在14、21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)肌內(nèi)和口服途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD3+CD4+T細(xì)胞百分率為36.35%～41.58%，均顯著高于對(duì)照組。在14、21、28 d，rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻途徑誘導(dǎo)的CD3+CD8+T細(xì)胞百分率為12.39%～18.32%；在28 d，rAd/Cap/518經(jīng)口服免疫誘導(dǎo)的CD3+CD8+T細(xì)胞百分率為16.29%，均顯著高于對(duì)照組。

表1 rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中T細(xì)胞亞群變化

2.3 免疫小鼠脾臟淋巴和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞因子檢測(cè)

從圖2可以看出，與對(duì)照組相比，滴鼻免疫組小鼠脾臟淋巴和腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞中IFN-γ分泌量顯著升高，分別達(dá)到299.5 pg/mL和635.5 pg/mL。各組均未檢測(cè)到IL-4。

圖2 不同途徑免疫rAd/Cap/518小鼠脾臟和腸系膜淋巴細(xì)胞因子的分泌表達(dá)

2.4 qPCR檢測(cè)免疫小鼠淋巴結(jié)、脾臟和肺組織PCV2病毒載量

從圖3可以看出，與對(duì)照組相比，經(jīng)滴鼻、口服和肌內(nèi)3種途徑免疫rAd/Cap/518后，小鼠臟器組織中PCV2病毒載量顯著降低。

圖3 小鼠臟器組織中PCV2 病毒載量

3 結(jié)論與討論

PCV2通過(guò)黏膜侵入機(jī)體，是引起PMWS的主要病原，各國(guó)學(xué)者均致力于研究有效的疫苗來(lái)防控PMWS。本研究將rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻、口服和肌內(nèi)3種免疫途徑免疫小鼠，評(píng)價(jià)其所誘導(dǎo)的全身性和局部黏膜免疫應(yīng)答效果。結(jié)果顯示，rAd/Cap/518經(jīng)不同途徑免疫小鼠均可不同程度誘導(dǎo)血清PCV2特異性IgG抗體的產(chǎn)生，這與WANG等[15]的報(bào)道結(jié)果一致。黏膜疫苗能在黏膜部位有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgA抗體[20]。rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻和口服免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的PCV2特異性IgA抗體，這與前人研究結(jié)果一致[21-22]。rAd/Cap/518經(jīng)滴鼻和口服途徑免疫能在唾液、肺部和腸道灌洗液中產(chǎn)生較高水平IgA抗體，肌內(nèi)途徑免疫后期腸道灌洗液中檢出微弱的IgA抗體，與CRAIG等[23]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果表明，腺病毒載體疫苗經(jīng)黏膜途徑免疫后可誘導(dǎo)局部黏膜部位產(chǎn)生IgA抗體以及血清IgG抗體。

細(xì)胞免疫應(yīng)答在控制免疫缺陷性疾病中起重要作用[24]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，rAd/Cap/518誘導(dǎo)小鼠脾臟CD3+T細(xì)胞含量顯著增加，肌內(nèi)和口服途徑免疫組CD3+CD4+T細(xì)胞顯著增加，滴鼻免疫組CD3+CD8+T細(xì)胞顯著增加?？梢?jiàn)，rAd/Cap/518可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，且滴鼻免疫可能會(huì)起到更好的免疫保護(hù)作用。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平進(jìn)一步研究rAd/Cap/518所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)類型，結(jié)果顯示，滴鼻免疫組檢測(cè)到高水平的IFN-γ，但各組均未檢出IL-4。表明誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)以Th1型為主。攻毒后體內(nèi)病毒載量檢測(cè)結(jié)果顯示，rAd/Cap/518經(jīng)3種途徑免疫組病毒載量均顯著降低，表明rAd/Cap/518免疫后能有效阻止病毒感染。

綜上，本研究將rAd/Cap/518經(jīng)口服、滴鼻和肌內(nèi)3種途徑免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)滴鼻和口服途徑免疫能誘導(dǎo)全身性和局部黏膜免疫應(yīng)答，并且能顯著清除PCV2感染，因此其具有很大應(yīng)用前景。雖然小鼠可作為PCV2感染研究的理想動(dòng)物模型[25]，但rAd/Cap/518在豬體內(nèi)的應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步研究。