程 璇，付朋飛，杜永坤，褚貝貝，楊國宇，王 江

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科、雙鏈DNA病毒，基因組大小約150 kb，可引起豬和多種家畜發(fā)病，其中豬是該病原的主要宿主和傳染源。PRV引起豬發(fā)病時(shí)主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙、發(fā)熱，以及仔豬急性死亡等癥狀[1-4]。近年來，在我國很多地區(qū)暴發(fā)了豬偽狂犬病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

PRV基因組編碼70多個(gè)α-皰疹病毒同源性蛋白[5]，有11種囊膜蛋白在病毒復(fù)制的各個(gè)階段發(fā)揮作用，其中g(shù)B蛋白是PRV囊膜主要的保護(hù)性抗原糖蛋白，不僅能誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而且對(duì)病毒的感染和復(fù)制過程是必需的[6-9]。gB蛋白由gBa(110～125 ku)、gBb(68～74 ku)、gBc(55～58 ku)3種糖蛋白以二硫鍵連接構(gòu)成同源二聚體復(fù)合物，均來自gB基因編碼的同一蛋白前體[10-13]。gBb和gBc由gBa水解而成，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生依賴補(bǔ)體和不依賴補(bǔ)體的2種中和抗體[1]。gB基因在皰疹病毒成員中為最保守的糖蛋白基因，gB蛋白免疫原性相對(duì)較好，且對(duì)于病毒的感染必不可少[14-15]。為此，制備 PRV gB蛋白單克隆抗體并研究其特異性，旨在為PRV鑒定與gB蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料及供試動(dòng)物

PRV HN1201株、PRV QXX株、PRV Barth K61株、PK-15細(xì)胞、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞、感受態(tài)細(xì)胞Top10、pCAGGS-HA質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室保存；聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜購自Millipore公司；HybGro雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基購自上海源培生物科技股份有限公司；β-丙內(nèi)酯購自Solarbio公司；佐劑Quick Antibody-Mouse 5W購自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；HAT/HT培養(yǎng)基、融合劑PEG1450、FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(IgG-FITC)、商業(yè)化β-actin鼠源單克隆抗體等均購自Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；AEC酶底物試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)Marker購自Thermo Fisher公司；ProteinIso?Protein G Resin購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；IgG抗體亞類鑒定試劑盒購自Sino Biological公司。

清潔級(jí)BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.2 PRV HN1201株的增殖與純化

鋪PK-15細(xì)胞至T75瓶，待其生長至鋪滿瓶底，接種PRV HN1201病毒液(毒價(jià)107.5TCID50/0.1 mL)0.5 mL，24 h后約90%細(xì)胞病變，收毒并凍融3次，8 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞上清，取10 mL上清經(jīng)30%蔗糖層26 000 r/min離心2 h，棄上清，用0.5 mL無菌PBS重懸病毒沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PRV HN1201株的滅活與小鼠免疫

取PRV HN1201株濃縮病毒液，加入β-丙內(nèi)酯(終含量為0.2%)混勻后置4 ℃滅活48 h，佐劑Quick Antibody-Mouse 5W與濃縮病毒液按1∶1比例配制疫苗，腿部肌肉注射免疫7周齡BALB/c小鼠，免疫劑量為100 μL/只。21 d后加強(qiáng)免疫1次，免疫劑量及途徑同首免；首免35 d后，采小鼠尾靜脈血，Dot blot法檢測(cè)血清抗體水平。Dot blot法：裁剪PVDF膜并標(biāo)記，取3 μL濃縮病毒液，滴加于PVDF膜上并風(fēng)干，5% BSA(1×TBST配制)室溫封閉2 h。小鼠尾靜脈采血，離心收集血清，用PBS將血清進(jìn)行2倍系列稀釋(2-1—2-11)，稀釋后血清滴加于病毒區(qū)，室溫作用1 h，PBST洗膜后室溫孵育HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)1 h，洗膜后顯影觀察。比較所有血清抗體水平，取抗體水平最高小鼠腹腔注射滅活病毒(100 μL/只)進(jìn)行沖擊免疫。

1.4 細(xì)胞融合

斷頸處死沖擊免疫3 d后的小鼠，無菌分離脾臟，常規(guī)方法制備小鼠脾臟細(xì)胞，按1∶10比例與SP2/0細(xì)胞混合，1 200 r/min離心10 min，棄上清；輕敲離心管使細(xì)胞混勻，置37 ℃水浴，滴加37 ℃預(yù)熱的PEG-1450(1 mL/min，邊加邊混勻)1 mL，37 ℃作用90 s；3 min內(nèi)加入14 mL 37 ℃預(yù)熱DMEM，邊加邊搖，37 ℃靜止5 min，緩慢補(bǔ)加DMEM至40 mL，1 000 r/min離心10 min，棄去上清，加適量預(yù)熱HAT培養(yǎng)基，混勻后鋪96孔板進(jìn)行培養(yǎng)[16]。

1.5 單克隆抗體篩選

1.5.1 分泌PRV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選 IPMA試驗(yàn)篩選分泌PRV抗體雜交瘤細(xì)胞，鋪PK-15細(xì)胞至96孔板，接種PRV HN1201(MOI=0.1)，10 h后用預(yù)冷3% H2O2甲醇室溫固定15 min；棄固定液，PBST洗2次，拍干，加5%脫脂奶37 ℃封閉1 h；棄封閉液，PBST洗5遍，拍干，加融合細(xì)胞分泌上清100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；棄上清，PBST洗5遍，拍干，加1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；棄二抗，PBST洗5遍，拍干，加AEC顯色液顯色，顯微鏡觀察并拍照，篩選出分泌PRV抗體的雜交瘤細(xì)胞株[11]。

1.5.2 分泌PRV gB蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞篩選及亞克隆 克隆PRV HN1201株gB基因并連接至pCAGGS-HA真核表達(dá)載體，獲得表達(dá)PRV HN1201 gB蛋白的pCAGGS-HA-gB質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，在1.5.1中篩選結(jié)果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用常規(guī)Western blot方法篩選分泌PRV gB蛋白抗體的單克隆細(xì)胞系。通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆純化，篩選出分泌PRV gB蛋白抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

1.6 腹水的制備及抗體純化

取6～8 周齡BALB/c雌性小鼠腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐劑，7 d后腹腔接種長勢(shì)良好的分泌PRV gB單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，3×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞/只，另設(shè)陰性對(duì)照組小鼠，腹腔注射SP2/0細(xì)胞(3×106個(gè)/只)。待小鼠腹部膨大且有波動(dòng)感時(shí)采集腹水，10 000 r/min離心10 min 收集上清，用硫酸銨沉淀法和ProteinIso?Protein G Resin進(jìn)行抗體純化，加甘油(終含量50%)-20 ℃保存，并用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)純化的抗體純度進(jìn)行鑒定。

1.7 單克隆抗體亞型鑒定

按照IgG亞類鑒定試劑盒說明書操作，對(duì)獲得的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。

1.8 單克隆抗體與不同PRV毒株反應(yīng)特性的IFA鑒定

將不同PRV病毒株分別接種PK-15細(xì)胞，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)10 h，用預(yù)冷的含3% H2O2的甲醇進(jìn)行固定，加入雜交瘤細(xì)胞上清，37 ℃作用1 h，洗滌后加入FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶1 000)二抗，37 ℃作用1 h，洗滌后于熒光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。同時(shí)設(shè)立SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清和未接毒PK-15細(xì)胞作為陰性對(duì)照[17]。

1.9 抗體效價(jià)檢測(cè)

取1.6步驟中純化小鼠腹水所得抗體，并參照1.8中試驗(yàn)步驟對(duì)其進(jìn)行IFA抗體效價(jià)檢測(cè)。采用固定病毒-稀釋腹水法(β法)，對(duì)小鼠腹水抗體的PRV中和效價(jià)進(jìn)行檢測(cè)[18]。同時(shí)對(duì)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水純化抗體用于Western blot的最佳稀釋比例進(jìn)行探索。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅活PRV HN1201株免疫小鼠血清抗體水平

小鼠首免后第35天，取尾靜脈血分離血清，2倍梯度稀釋后，Dot blot法檢測(cè)血清PRV抗體水平，7只小鼠均分泌PRV抗體，其中3號(hào)小鼠抗體水平最高達(dá)到2-11，取3號(hào)小鼠用滅活PRV進(jìn)行腹腔沖擊免疫。

2.2 分泌PRV gB蛋白單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立

將SP2/0細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞融合，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選后5～7 d即可明顯觀察到融合細(xì)胞增殖(圖1)，經(jīng)IPMA和Western blot對(duì)多株融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，最終獲得1株抗PRV gB蛋白單克隆抗體，并將其命名為3B-3。IPMA結(jié)果(圖2)顯示，制備的單克隆抗體可有效檢測(cè)PRV HN1201株感染的PK-15細(xì)胞。PRV HN1201株感染PK-15細(xì)胞與pCAGGS-HA-gB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞的Western blot結(jié)果(圖3)顯示，單克隆抗體3B-3可特異檢測(cè)PRV gB蛋白。

A：融合后5 d；B：融合后7 d

A：PRV HN1201株感染PK-15細(xì)胞；B：正常PK-15細(xì)胞

A：單克隆抗體3B-3的Western blot鑒定；B：β-actin Western blot鑒定。M：蛋白質(zhì)Marker；1：PK-15細(xì)胞蛋白；2：感染PRV HN1201后PK-15細(xì)胞蛋白；3：轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-gB質(zhì)粒后PK-15細(xì)胞蛋白；4—6：β-actin

2.3 PRV gB蛋白單克隆抗體純化效果及Ig亞型鑒定

單克隆抗體亞類鑒定結(jié)果表明，制備的單克隆抗體屬IgG1型。純化抗體經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，可于50 ku和25 ku左右見到2條明顯的蛋白質(zhì)條帶(圖4)，分別為抗體的重鏈和輕鏈，條帶大小與商業(yè)化β-actin鼠源單克隆抗體條帶大小一致，且純化效果較好。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：腹水純化后單克隆抗體；2：β-actin單克隆抗體

2.4 PRV gB蛋白單克隆抗體與不同PRV毒株反應(yīng)特性的IFA鑒定

不同PRV病毒株分別接種PK-15細(xì)胞，固定細(xì)胞進(jìn)行IFA試驗(yàn)，檢測(cè)PRV gB蛋白單克隆抗體與不同PRV毒株的反應(yīng)特性。結(jié)果顯示，制備的單克隆抗體與不同PRV毒株均特異性反應(yīng)，熒光主要集中于細(xì)胞核周圍，并且與轉(zhuǎn)染pCAGGS-HA-gB質(zhì)粒所表達(dá)的PRV gB蛋白也反應(yīng)，不與PK-15細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)(圖5)。

圖5 IFA鑒定單克隆抗體與不同PRV毒株反應(yīng)特異性

2.5 PRV gB蛋白單克隆抗體效價(jià)檢測(cè)

將腹水純化后的PRV gB蛋白單克隆抗體用PBS進(jìn)行2倍系列稀釋，作為一抗檢測(cè)感染PRV HN1201的細(xì)胞，結(jié)果顯示，所純化抗體IFA檢測(cè)效價(jià)為2-11(圖6)。中和試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，小鼠腹水抗體的PRV中和效價(jià)為1∶25。雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水純化抗體用于Western blot的最佳稀釋比為1∶50和1∶5 000。

圖6 IFA檢測(cè)小鼠腹水純化后PRV gB蛋白抗體效價(jià)

3 結(jié)論與討論

PRV是影響我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的主要病原體之一，動(dòng)物感染PRV后，病毒可在神經(jīng)節(jié)中長期潛伏，對(duì)整個(gè)豬群健康形成潛在威脅[19-21]。2011年國內(nèi)豬群發(fā)生了由偽狂犬病毒變異株引起的豬偽狂犬病，至今已給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失，而且新PRV變異株毒力變強(qiáng)機(jī)制尚無確切定論，對(duì)于其臨床檢測(cè)及致病機(jī)制研究仍迫在眉睫[22-26]。

gB蛋白是PRV囊膜主要的保護(hù)性抗原糖蛋白，不僅可以刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而且對(duì)病毒的感染和復(fù)制過程是必需的[27-31]。本研究以變異株P(guān)RV HN1201為抗原，將其濃縮純化并滅活后免疫小鼠，取免疫后小鼠脾臟細(xì)胞與SP/20細(xì)胞融合，篩選出1株穩(wěn)定分泌PRV gB蛋白抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞系。其他相關(guān)研究往往通過構(gòu)建PRVgB原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)gB蛋白并純化后免疫小鼠制備單克隆抗體，本研究以滅活全病毒為抗原進(jìn)一步結(jié)合IPMA檢測(cè)方法，利用抗體與病毒感染的細(xì)胞發(fā)生特異反應(yīng)，有效避免了所制備的單克隆抗體僅僅與原核表達(dá)蛋白結(jié)合而無法識(shí)別PRV病毒的問題。同時(shí)，本研究采用適應(yīng)無血清培養(yǎng)基的SP/20小鼠骨髓瘤細(xì)胞，整個(gè)雜交瘤細(xì)胞制備過程均無需添加胎牛血清，不僅節(jié)約成本更避免了因血清質(zhì)量問題帶來的試驗(yàn)失敗。

本研究制備的雜交瘤細(xì)胞系所分泌抗體為IgG1亞型，腹水純化抗體的IFA效價(jià)為2-11；細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水純化抗體用于Western blot的最佳稀釋比例為1∶50和1∶5 000；小鼠腹水抗體的PRV中和效價(jià)為1∶25。IPMA、IFA及Western blot試驗(yàn)結(jié)果顯示，制備的單克隆抗體可特異性檢測(cè)PRV gB蛋白，并可特異性識(shí)別多種PRV病毒株，這為PRV鑒定及其致病機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。