李林盼，歐 靜，陳榮建，楊舒婷，何躍軍

(貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

桃葉杜鵑(Rhododendronannae)系杜鵑花科杜鵑屬植物，其樹(shù)形、花色都極具觀(guān)賞性[1]。桃葉杜鵑分布于高海拔地區(qū)，是典型的杜鵑花類(lèi)菌根(ERM，Ericoidmycorrhizas)植物，但其不耐干旱的特性使其在園林觀(guān)賞應(yīng)用方面受到限制。因此，迫切需要解決桃葉杜鵑在栽培養(yǎng)護(hù)中不耐干旱的難題。迄今，關(guān)于ERM對(duì)桃葉杜鵑的影響研究集中在種子萌發(fā)及幼苗移植[2]、光合性能[3]、促生效益及生理生化[4]方面，同時(shí)也從生長(zhǎng)[5]、光合參數(shù)[6]、熒光參數(shù)[7]、內(nèi)源激素[8]、生理特性[9]、顯微結(jié)構(gòu)[10-11]等方面報(bào)道了ERM對(duì)桃葉杜鵑抗旱能力的影響。但關(guān)于ERM是如何動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)桃葉杜鵑游離脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及內(nèi)源激素含量來(lái)緩解重度干旱對(duì)其造成傷害的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，而往往重度干旱對(duì)桃葉杜鵑生長(zhǎng)更為不利。鑒于此，以桃葉杜鵑菌根苗為材料，通過(guò)人工盆控水試驗(yàn)，研究重度干旱環(huán)境下，ERM對(duì)桃葉杜鵑生理生化指標(biāo)的影響，以期為闡明ERM提高桃葉杜鵑抗重度干旱脅迫機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g、瓊脂粉20.0 g、蒸餾水1 000 mL，121 ℃條件下高溫高壓蒸汽滅菌20 min。

供試菌株：TY29(AB158314:Trametesochracea)、TY35(AB378554:Pochoniabulbillosa)由野外桃葉杜鵑根系分離保存[2]，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，接種后置于25 ℃、暗環(huán)境下培養(yǎng)14 d，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)基質(zhì)后作為菌劑使用；桃葉杜鵑種子：采自貴州省百里杜鵑方家坪，用0.5% KMnO4溶液消毒15 min,再用無(wú)菌水漂洗干凈后播種；播種基質(zhì)：腐殖土、珍珠巖按3∶1體積比混合，在121 ℃條件下高溫高壓蒸汽滅菌20 min,自然冷卻備用。育苗基質(zhì)：采自百里杜鵑方家坪桃葉杜鵑林下腐殖質(zhì)土。

1.2 方法

在花盆(高18.5 cm、內(nèi)口徑21 cm)中裝入2/3高度的播種基質(zhì)，鋪上長(zhǎng)滿(mǎn)菌絲的PDA培養(yǎng)基(CK鋪無(wú)菌絲PDA培養(yǎng)基)后覆蓋少量基質(zhì)，均勻播撒桃葉杜鵑種子，用滅菌后的松針覆蓋，放入溫度25 ℃、相對(duì)濕度85%、光照24 h的人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)。待幼苗出土生長(zhǎng)120 d后，將各接菌處理移栽到裝入等量育苗基質(zhì)的塑料花盆(高10 cm、內(nèi)口徑11 cm)中，每盆1株，放置貴州大學(xué)林學(xué)院苗圃大棚內(nèi)進(jìn)行菌根苗培育管理。2016年7月，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的植株開(kāi)始控水。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)土壤相對(duì)含水量處理，即W：80%～90%(正常水分條件)，T：35%～40%(重度干旱脅迫)。每個(gè)處理重復(fù)30盆。按盆栽控水法，每天17:00稱(chēng)質(zhì)量(電子稱(chēng)質(zhì)感0.1 g),維持土壤相對(duì)含水量在試驗(yàn)所需范圍內(nèi)，在水分處理期間的當(dāng)天(0 d)和7、14、21、28 d取頂芽向下第4片功能葉，根系取樣部位為須根，對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行隨機(jī)取樣檢測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

游離Pro含量采用酸性茚三酮顯色法測(cè)定，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑光還原法測(cè)定[12]。內(nèi)源激素含量測(cè)定取樣方法參照陳榮建等[8]方法，待全部取樣完成后送中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用WPS記錄數(shù)據(jù)及繪圖，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析和Duncan’s多重比較法進(jìn)行方差檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)桃葉杜鵑游離Pro含量的影響

由圖1可見(jiàn)，正常水分條件下，各處理游離Pro含量變化不明顯；重度干旱初期，接種ERM菌株桃葉杜鵑游離Pro含量與CK差異不大，隨著重度干旱脅迫時(shí)間持續(xù)，7 d時(shí)，各處理游離Pro含量上升，與CK相比接菌處理游離Pro含量上升較快；14 d時(shí)，TY29和TY35處理游離Pro含量達(dá)到最大值，較CK分別增加278.45%、437.62%。在21 d和28 d，桃葉杜鵑游離Pro含量下降，接種ERM菌株桃葉杜鵑游離Pro含量均高于CK；在28 d，重度脅迫下CK Pro含量較正常水分降低54.96%，而TY29和TY35處理在重度干旱脅迫下仍保持接近正常水分條件的游離Pro含量。

不同小、大寫(xiě)字母表示同一時(shí)間同一水分條件下不同接菌處理差異顯著(P<0.05)、差異極顯著(P<0.01),下同

2.2 不同處理對(duì)桃葉杜鵑SOD活性的影響

由圖2可知，在正常水分條件下及干旱初期，桃葉杜鵑苗SOD活性差異不大；隨著重度干旱脅迫時(shí)間增加，桃葉杜鵑SOD活性呈上升變化，在14 d時(shí)達(dá)到最大值，接種ERM菌株處理與CK差異極顯著(P<0.01)，TY29和TY35處理較CK分別增加194.82%、160.70%；在21 d和28 d，桃葉杜鵑SOD活性隨著脅迫的持續(xù)呈逐漸降低的趨勢(shì)，低于各處理正常水分條件下的含量，接菌處理始終高于CK。

圖2 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗SOD活性變化

2.3 不同處理對(duì)桃葉杜鵑MDA含量的影響

由圖3可知，重度干旱下，桃葉杜鵑MDA含量隨脅迫增加呈升高-降低變化，接菌處理與CK差異明顯。在干旱脅迫初期，MDA含量隨脅迫時(shí)間持續(xù)呈增加變化，CK重度干旱下變幅最大，在14 d達(dá)到最大值，較正常水分條件下增加120.69%，隨后呈下降變化。21 d時(shí)，TY29和TY35處理在重度干旱下MDA含量急劇上升并達(dá)到最大值，分別較正常水分條件下增加116.48%、198.41%，與CK差異極顯著(P<0.01)。與21 d相比，28 d時(shí)各處理在重度干旱條件下MDA含量急劇下降，接菌處理始終高于CK。

圖3 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗MDA含量變化

2.4 不同處理對(duì)桃葉杜鵑IAA含量的影響

由圖4可知，重度干旱脅迫0 d和7 d，接種ERM菌株葉片、根系IAA含量都有不同程度的增加，以7 d增幅最大，TY29和TY35處理葉片IAA含量分別較CK增加48.41%、47.71%，TY35處理根系IAA含量較CK增加29.39%,TY29處理則稍低于CK,差異不顯著。14 d和21 d，葉片IAA含量呈下降變化，根系IAA含量達(dá)到最大值，接菌處理高于CK，差異極顯著(P<0.01)；21 d，TY29、TY35處理葉片IAA含量較CK分別增加121.7%、60.21%，根系IAA含量較CK分別增加48.64%、69.09%。28 d，接種ERM菌株葉片IAA含量迅速增加，與CK差異極顯著(P<0.01)，TY29和TY35處理分別較CK在重度脅迫下增加181.46%、140.65%，根系IAA含量呈降低變化。

圖4 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗葉片、根系IAA含量變化

2.5 不同處理對(duì)桃葉杜鵑ABA含量的影響

由圖5可見(jiàn)，正常水分條件下，CK與接菌處理桃葉杜鵑葉片及根系A(chǔ)BA含量差異不一；隨著重度脅迫時(shí)間的持續(xù)，桃葉杜鵑葉片及根系A(chǔ)BA含量急劇上升，根系A(chǔ)BA含量高于葉片。0 d時(shí)，正常水分條件下，TY29和TY35處理葉片、根系A(chǔ)BA含量分別較CK增加26.36%、49.90%和20.24%、38.47%；重度干旱下，葉片ABA在始終保持較高的含量，根系A(chǔ)BA在7、14 d呈上升變化，在14 d達(dá)到最大值并維持較高的ABA含量，TY29和TY35處理葉片、根系A(chǔ)BA含量分別較CK增加16.36%、32.72%和23.43%、46.26%。

圖5 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗葉片、根系A(chǔ)BA含量變化

2.6 不同處理對(duì)桃葉杜鵑GA3含量的影響

由圖6可見(jiàn)，重度干旱脅迫下，桃葉杜鵑GA3含量隨著脅迫時(shí)間持續(xù)呈升高變化，接種ERM菌株能增加桃葉杜鵑GA3含量。隨著脅迫持續(xù)，葉片和根系GA3含量都有不同程度的增加；桃葉杜鵑葉片GA3含量整體變化不大，以重度干旱28 d時(shí)差異最大，TY29和TY35處理較CK分別增加42.48%、44.61%；重度干旱下，CK根系GA3含量在7 d較0 d增加后呈降低變化，接菌處理根系GA3含量呈增加趨勢(shì)并保持較高水平，以14 d增幅和差異最大，TY29處理較正常水分條件下增加43.57%，較CK增加43.60%，TY35處理較正常水分條件下增加23.30%，較CK增加37.93%。

圖6 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗葉片、根系GA3含量變化

2.7 不同處理對(duì)桃葉杜鵑ZR含量的影響

由圖7可見(jiàn)，隨著脅迫時(shí)間持續(xù)，桃葉杜鵑ZR含量呈升高降低變化，接種ERM菌株對(duì)桃葉杜鵑ZR含量影響不一。重度干旱下，CK桃葉杜鵑葉片ZR含量變化不大，接菌處理能適當(dāng)增加葉片ZR含量，TY35處理在21 d和28 d差異極顯著(P<0.01)，21 d時(shí)各處理葉片ZR含量達(dá)到最大值，28 d各處理葉片ZR含量呈降低變化，重度干旱下CK、TY29和TY35處理分別較21 d下降32.35%、39.71%、39.05%；0～7 d，CK根系ZR含量變化不大，TY29處理呈降低變化，TY35處理呈增加變化，在14 d和21 d，根系ZR含量均有不同程度增加，根系ZR含量高于葉片，14 d重度干旱脅迫下根系ZR含量的增幅最大，CK、TY29和TY35處理分別較正常水分下增加37.77%、17.23%、51.28%，重度干旱脅迫28 d根系ZR含量呈降低變化，CK、TY29和TY35處理分別較21 d下降24.53%、31.51%、25.40%。

圖7 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗葉片、根系ZR含量變化

2.8 不同處理對(duì)桃葉杜鵑IAA/ABA、ZR/ABA、(IAA+ZR+GA3)/ABA值的影響

重度干旱下IAA/ABA、ZR/ABA、(IAA+ZR+GA3)/ABA值總體呈下降變化。IAA/ABA值越高，生長(zhǎng)越快，IAA/ABA值越小越促進(jìn)植物休眠。由表1可見(jiàn)，重度干旱下，接種ERM菌株IAA/ABA值高于CK，IAA/ABA值降幅小于CK，CK、TY29和TY35處理在28 d較0 d分別下降66.30%、35.35%和22.29%。由表2可見(jiàn)，重度干旱脅迫下，接種ERM菌株ZR/ABA值低于CK，對(duì)桃葉杜鵑生長(zhǎng)起抑制作用，28 d時(shí)，TY29和TY35處理的ZR/ABA值分別低于CK 0.29%和11.36%，隨著脅迫持續(xù)，接菌處理可以通過(guò)減少ZR含量來(lái)降低細(xì)胞分裂活動(dòng)，降低對(duì)水分的消耗，增強(qiáng)桃葉杜鵑保水能力。重度水分脅迫下，接種ERM菌株(IAA+ZR+GA3)/ABA值高于CK，在28 d時(shí)，TY29和TY35處理分別較CK增加51.20%和40.70%(表3)。

表1 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗IAA/ABA值變化

表2 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗ZR/ABA值變化

表3 不同水分條件下桃葉杜鵑菌根苗(IAA+ZR+GA3)/ABA值變化

2.9 不同處理對(duì)桃葉杜鵑內(nèi)源激素與生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表4可知，對(duì)重度干旱脅迫下桃葉杜鵑菌根苗內(nèi)源激素與生理生化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析得出，菌株與SOD活性、Pro、IAA、ABA、GA3、ZR含量顯著正相關(guān)，IAA、ABA、GA3、ZR與Pro含量、SOD活性呈顯著正相關(guān)，IAA含量與GA3、ZR含量呈顯著正相關(guān)，ABA含量與GA3含量呈顯著正相關(guān)，表明接種ERM菌株能增加桃葉杜鵑內(nèi)源激素含量及協(xié)作能力，有利于提高桃葉杜鵑滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、保護(hù)酶活性，降低重度干旱的傷害，維持桃葉杜鵑在重度干旱下的生長(zhǎng)能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力與適應(yīng)能力。

3 結(jié)論與討論

干旱環(huán)境下，植物通過(guò)多種因素的相互作用來(lái)增強(qiáng)其抗旱能力，本試驗(yàn)通過(guò)測(cè)定幾個(gè)生理指標(biāo)的變化來(lái)研究ERM對(duì)桃葉杜鵑抗旱能力的作用。Pro含量是反映鑒定植物抗逆性的生理指標(biāo)[13]。本研究中，重度脅迫處理的14 d，TY29、TY35處理游離Pro含量分別較CK增加278.45%、437.62%，其原因可能為此時(shí)桃葉杜鵑遭受?chē)?yán)重的干旱脅迫，ERM菌株迅速合成更多的游離Pro來(lái)進(jìn)行生理調(diào)節(jié)，但調(diào)節(jié)能力隨脅迫時(shí)間持續(xù)在21 d開(kāi)始呈下降變化；重度干旱脅迫28 d時(shí)CK游離Pro含量下降最快，較正常水分降低54.96%，而TY29和TY35處理仍保持正常水分條件的游離Pro含量，可能是此時(shí)干旱脅迫已經(jīng)對(duì)桃葉杜鵑形成嚴(yán)重的傷害，影響游離Pro的合成，但接種ERM菌株桃葉杜鵑游離Pro含量始終高于CK，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱能力。

有研究認(rèn)為，SOD和CAT活性上升能增強(qiáng)植物耐旱性[14]，本試驗(yàn)與前人對(duì)山杏接種叢枝菌根真菌的研究結(jié)果相似[15]，重度干旱下，ERM菌株顯著提高了桃葉杜鵑SOD活性并延緩了MDA生成，說(shuō)明接種ERM菌株能明顯緩解干旱對(duì)苗木細(xì)胞造成的傷害。重度脅迫21 d，接菌處理MDA含量迅速上升而CK增幅不大，可能是因?yàn)榇藭r(shí)干旱脅迫的傷害超過(guò)了SOD調(diào)節(jié)修復(fù)能力，ERM菌株較CK有較強(qiáng)的干旱傷害承受能力。

干旱逆境下植物可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的增加或者減少來(lái)傳遞干旱信息進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，緩解脅迫壓力[16]，耐旱性強(qiáng)的品種較耐旱性弱的品種將積累更多的ABA含量[17]。有研究表明，菌根真菌在促進(jìn)菌根植物營(yíng)養(yǎng)吸收、增強(qiáng)對(duì)逆境因子的抗性等方面作用重大[18]，土壤水分脅迫、接菌處理對(duì)植株內(nèi)源激素含量都有不同程度的影響[19]。一般來(lái)說(shuō)，植物在受到逆境脅迫時(shí)，為了提高水分利用率從而增強(qiáng)抗旱能力，其內(nèi)源激素會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化[20]且接菌處理能讓植物內(nèi)源激素發(fā)生變化且大多具有偏好性[21]，本研究表明，重度脅迫下接菌處理均顯著影響了桃葉杜鵑幼苗內(nèi)源激素含量的變化，且對(duì)其變化產(chǎn)生了積極的影響，這與已有研究結(jié)果相似[8]。有研究表明，受到干旱脅迫的植物體內(nèi)IAA含量總體呈下降變化，本研究表明，ERM菌株顯著增加桃葉杜鵑根系IAA含量，隨著重度干旱持續(xù)，桃葉杜鵑葉片IAA含量呈升高-降低-升高變化，根系IAA含量則呈先升高后降低趨勢(shì)。這可能是因?yàn)槊{迫初期高含量的IAA有利于根系保持旺盛的生命活動(dòng)誘導(dǎo)側(cè)根的起始和延伸[22]，降低干旱帶來(lái)的傷害；而當(dāng)脅迫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，根系通過(guò)減少I(mǎi)AA含量來(lái)降低細(xì)胞生命活動(dòng)應(yīng)對(duì)干旱傷害。有研究表明，ABA對(duì)氣孔的關(guān)閉有調(diào)控作用[17]，重度干旱脅迫下接菌處理葉片ABA含量始終保持在較高水平，可能是ERM菌株通過(guò)合成更多的ABA來(lái)調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞膨壓，增加桃葉杜鵑在干旱條件下的保水能力。本研究中接菌處理根系GA3含量呈增加趨勢(shì)并保持較高水平，在重度干旱脅迫14 d時(shí)增幅最大，這可能是ERM菌株促進(jìn)了GA3的合成，而GA3是減緩植物生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控信號(hào)[23]，接菌能增加GA3含量來(lái)減緩桃葉杜鵑生長(zhǎng)使其更好地適應(yīng)干旱脅迫。重度干旱下，CK桃葉杜鵑葉片和根系ZR含量變化不大，接種ERM菌株處理桃葉杜鵑葉片和根系ZR含量隨重度脅迫時(shí)間的持續(xù)呈先升高后降低變化，在28 d時(shí)ZR含量急劇下降，這與已有研究類(lèi)似[24]，可能是因?yàn)閆R含量減少降低植株生長(zhǎng)速率，利于植物保持較高的水分狀態(tài)[25]，施用ERM菌株利于桃葉杜鵑降低其體內(nèi)ZR含量以此增加抗性。

很多研究都證實(shí)了干旱脅迫下內(nèi)源激素相互協(xié)調(diào)作用以調(diào)節(jié)植物的抗旱性[26]，植物受到脅迫后通過(guò)調(diào)節(jié)IAA和ABA的含量來(lái)控制側(cè)根發(fā)育從而影響植株的抗旱能力[27]，有研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片的氣孔關(guān)閉和蒸騰作用減弱是ABA含量增加和ZR含量下降共同作用的結(jié)果，而(IAA+ZT)/ABA值下降幅度越大，植物耐旱性越強(qiáng)[28-29]。本研究中，重度干旱脅迫下，接菌處理IAA/ABA值降幅小于CK，表明接菌可以維持桃葉杜鵑較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力；在重度脅迫28 d，接菌處理(IAA+ZR+GA3)/ABA值高于CK，可能是因?yàn)殡S著脅迫時(shí)間的增加，ERM 菌株可有效調(diào)節(jié)多種內(nèi)源激素來(lái)應(yīng)對(duì)干旱脅迫，與CK相比表現(xiàn)出較強(qiáng)的內(nèi)源激素綜合調(diào)節(jié)能力。