劉甜甜,張 星,熊興耀,劉 韜,李曉剛,周 倩

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/植物疾病控制與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410128; 2.邵陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,湖南 邵陽 422000;3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜花卉研究所,北京 100081; 4.沅江市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,湖南 沅江 413100)

馬鈴薯屬茄科植物，塊莖含有大量淀粉，可食用，能夠提供人體所需的能量，因適合多種烹飪手法，受到大多數(shù)人的喜愛，目前已成為世界三大主糧之一，在解決全世界人民糧食安全問題上起著極為重要的作用[1]。致病疫霉(Phytophthorainfestans)引起的晚疫病一直以來嚴(yán)重威脅著馬鈴薯的生產(chǎn)。生產(chǎn)上多采用化學(xué)方法對馬鈴薯晚疫病進(jìn)行防控，但這種方法污染大，且長期大量使用化學(xué)藥劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性[2]，目前已有病原菌對廣泛使用的殺菌劑產(chǎn)生抗藥性的報(bào)道[3]。因而，開發(fā)新型生物殺菌劑極為重要。山蒼子(Litseacubeba)是樟科木姜子屬的芳香油植物，是我國特有的植物資源之一，從山蒼子的枝葉和果實(shí)中能夠分離提取得到一種淺黃色液體，即山蒼子油(Litseacubebaessential oil)[4]。山蒼子油帶有清鮮香甜的果香味并伴有鮮辣氣息，具有易揮發(fā)的特性，在抗菌、抗氧化、抗腫瘤以及驅(qū)蟲避害方面具有良好的開發(fā)利用前景，在化妝品、香料、食品等行業(yè)中被廣泛應(yīng)用[5]。近年來，關(guān)于山蒼子及其提取物對植物病原菌的研究越加廣泛，已有研究表明，山蒼子油果實(shí)中的主要成分檸檬醛具有廣譜抑菌活性，能夠通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、增加細(xì)胞膜通透性、使細(xì)胞內(nèi)容物外泄的方式導(dǎo)致菌絲死亡，對植物真菌、細(xì)菌病害具有良好的拮抗作用，極具開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[6-9]。另外，山蒼子中的其他活性物質(zhì)，如芳樟醇和香葉醇等，也與山蒼子油抑菌作用有關(guān)，且質(zhì)量濃度越高抑菌作用越強(qiáng)，隨著質(zhì)量濃度降低，抑菌效果出現(xiàn)急劇下降的現(xiàn)象[10]。郭丹等[11]研究了15種山蒼子油主要成分及其衍生物對油茶炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和水稻稻瘟病菌3種常見植物病原真菌的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15種化合物對3種病原菌的生長均產(chǎn)生一定的抑制作用。目前，山蒼子油對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌作用研究尚未見報(bào)道。鑒于此，為明確純植物提取物山蒼子油對馬鈴薯晚疫病是否能夠起到良好的抑菌作用，室內(nèi)和田間防效是否表現(xiàn)良好，是否具有應(yīng)用推廣價(jià)值，研究了25%山蒼子油水乳劑(EW)對馬鈴薯晚疫病的抑菌活性，并進(jìn)行了室內(nèi)及田間防效測定，旨在為山蒼子油及其制劑應(yīng)用于馬鈴薯晚疫病菌的防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和藥劑

馬鈴薯晚疫病菌強(qiáng)致病力生理小種菌種致病疫霉菌(P.infestans)CN152，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所謝丙炎老師課題組提供。

25%山蒼子油EW自制，其中含山蒼子油25%、溶劑乙酸仲丁酯15%、乳化劑TSC-110 4%、乳化劑TSC-120 4%、分散劑SK-355 4%、增稠劑黃原膠0.3%、防凍劑乙二醇5%、去離子水補(bǔ)足至100%。上述原料混合，在剪切機(jī)中高速剪切乳化制得25%山蒼子油EW。

銀法利(687.5 g/L氟吡菌胺·霜霉威懸浮劑)購自德國拜耳作物科學(xué)公司。

1.2 試驗(yàn)地概況和供試馬鈴薯品種

試驗(yàn)地位于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院試驗(yàn)基地。試驗(yàn)地土壤肥沃、地勢平整，灌溉條件良好。試驗(yàn)所選地塊環(huán)境條件均勻一致，符合田間試驗(yàn)要求。供試馬鈴薯品種為費(fèi)烏瑞它，選取健康、無明顯病斑的種薯，進(jìn)行切塊拌種處理后，放入已起壟、翻土和漚肥的試驗(yàn)地，種植密度為5.25×104株/hm2，于2018年1月開始種植。

1.3 培養(yǎng)基配制

黑麥培養(yǎng)基：黑麥草種子200 g、瓊脂條20 g、去離子水1 000 mL，pH值6.0。

1.4 山蒼子油對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌作用初篩

采用平皿菌絲生長抑制法。取配置好的49 mL黑麥培養(yǎng)基微波爐加熱約3 min，待培養(yǎng)基徹底融化后備用。適溫(不燙手為宜)將除菌處理過的山蒼子油加入到融化的黑麥培養(yǎng)基內(nèi)，分別配置成500倍稀釋和5 000倍稀釋的山蒼子油抑菌培養(yǎng)基，充分混勻，倒板，大風(fēng)吹干備用，以添加滅菌水的黑麥培養(yǎng)基作為對照(CK)。將直徑4 mm的馬鈴薯晚疫病菌菌餅接種至備好的平板中，18 ℃倒置暗培養(yǎng)約15 d，待對照培養(yǎng)基平板長滿菌絲時(shí)進(jìn)行觀察記錄，計(jì)算不同稀釋倍數(shù)的山蒼子油對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的抑制率。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-菌餅直徑)×100%。

1.5 25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)抑菌試驗(yàn)

經(jīng)1.4研究判定山蒼子油對馬鈴薯晚疫病具有生防潛力后，對山蒼子油進(jìn)行加工配制，得到了25%山蒼子油EW，進(jìn)行山蒼子油制劑的馬鈴薯晚疫病室內(nèi)毒力測定。試驗(yàn)設(shè)計(jì)包括清水對照、藥劑對照、25%山蒼子油EW的3個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，25%山蒼子油EW處理和藥劑對照分別進(jìn)行5個(gè)梯度的稀釋。25%山蒼子油EW從稀釋1 500倍開始，按1.2倍進(jìn)行5個(gè)梯度稀釋；藥劑對照(銀法利)從稀釋5 000倍開始，按1.2倍進(jìn)行5個(gè)梯度稀釋。接種4 mm菌餅后倒置于18 ℃培養(yǎng)箱，暗培養(yǎng)約15 d，待清水對照處理長滿菌絲后，觀察、記錄試驗(yàn)結(jié)果并拍照。

1.6 馬鈴薯晚疫病菌孢子懸浮液的制備及田間接種

田間接種前2周，將晚疫病菌接種于黑麥培養(yǎng)基上。接種時(shí)，先將長滿晚疫病菌的平板上的游動(dòng)孢子囊充分洗脫下來，于4 ℃誘導(dǎo)2 h，使游動(dòng)孢子釋放，并調(diào)整游動(dòng)孢子濃度至1.0×105個(gè)/mL。

馬鈴薯齊苗后生長約1個(gè)月，選擇天氣預(yù)報(bào)有連續(xù)陰雨的時(shí)機(jī)，進(jìn)行晚疫病菌接種試驗(yàn)。將準(zhǔn)備好的游動(dòng)孢子懸浮液采用活體噴霧接種的方法，均勻噴霧于馬鈴薯植株上，以在葉片上形成水滴為宜。

1.7 山蒼子油制劑對馬鈴薯晚疫病菌的田間防效試驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)3個(gè)處理：25%山蒼子油EW、藥劑對照(銀法利)、清水對照(CK)。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)區(qū)域面積約為12 m2。于晚疫病菌接種前的晴天傍晚進(jìn)行第1次藥劑噴施(用量為1 500 mL/hm2，其中25%山蒼子油EW稀釋500倍，銀法利稀釋1 000倍，后面2次施藥用量和濃度同此)，利用手動(dòng)噴藥器將藥液均勻噴灑在馬鈴薯植株上。第2天接種晚疫病菌，接種后7～12 d的晴天傍晚進(jìn)行第2次用藥，再間隔7～12 d后進(jìn)行第3次用藥，最后1次施藥完成7 d后進(jìn)行馬鈴薯晚疫病發(fā)病情況調(diào)查，并記錄施藥當(dāng)天天氣情況。

采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行調(diào)查，觀察發(fā)病情況，按葉片上病斑面積占整個(gè)葉面積的百分率進(jìn)行分級(表1)。根據(jù)葉片病斑，計(jì)算病情指數(shù)與防治效果。

表1 病情分級標(biāo)準(zhǔn)

100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。采用LSD兩兩差異檢驗(yàn)顯著性差異，P<0.05時(shí)，表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。使用SPSS 19.0計(jì)算置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子油對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌作用初篩

通過平板抑菌試驗(yàn)，初步觀察篩選山蒼子油對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌作用。結(jié)果(圖1)表明，當(dāng)對照平板上菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，含有山蒼子油的平板上完全沒有觀察到菌絲的生長。室內(nèi)平板試驗(yàn)中山蒼子油稀釋500倍和5 000倍均能完全抑制馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長，說明山蒼子油具有開發(fā)作為馬鈴薯晚疫病植物源藥劑的潛力。

圖1 山蒼子油對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌效果

2.2 25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)抑菌作用

室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明，25%山蒼子油EW的1 500倍和1 800倍稀釋液對馬鈴薯晚疫病菌的平板抑致率均達(dá)到94%以上。25%山蒼子油EW的EC50為94.126 5 mg/L，銀法利的EC50為2.619 6 mg/L，兩者之間有效抑制中濃度存在顯著差異。

表2 25%山蒼子油EW及銀法利的平板抑菌試驗(yàn)結(jié)果

25%山蒼子油EW和銀法利對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌效果如圖2和圖3。由圖2可見，在25%山蒼子油EW的前2個(gè)稀釋濃度下，只有極少量的菌絲生長，25%山蒼子油EW稀釋2 160倍的平板上明顯可見菌絲生長，且菌圈面積接近培養(yǎng)皿面積的1/2，菌絲生長形態(tài)正常。由圖3可以發(fā)現(xiàn)，在銀法利的初始稀釋倍數(shù)下雖然也有較好的抑制效果，但仍然可見生長出來的菌絲體，且銀法利的多個(gè)稀釋處理都出現(xiàn)菌圈的不規(guī)則生長現(xiàn)象，沒有明顯的菌圈邊緣，十字交叉法測量的組間差異較大。

a—e分別為山蒼子油EW在稀釋倍數(shù)為1 500、1 800、2 160、2 592、3 110時(shí)的室內(nèi)平板抑菌效果;CK為清水對照

a—e分別為銀法利在稀釋倍數(shù)為5 000、6 000、7 200、8 640、10 368 時(shí)的室內(nèi)平板抑菌效果;CK為清水對照

2.3 25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的田間防效試驗(yàn)結(jié)果

由表3可見，25%山蒼子油EW和銀法利都表現(xiàn)出了對馬鈴薯晚疫病良好的防治效果，防效均達(dá)到了75%及以上。其中25%山蒼子油EW的田間防效為75.00%；銀法利的田間防效為80.05%，能夠有效控制馬鈴薯晚疫病的發(fā)生危害，且銀法利的田間防效稍優(yōu)于25%山蒼子油EW。綜合上述結(jié)果，與清水對照相比，山蒼子油EW和銀法利對田間馬鈴薯晚疫病菌的侵染危害均表現(xiàn)出良好的抑制作用，在推薦用量下，銀法利的防效稍好于山蒼子油。

表3 25%山蒼子油EW及銀法利對馬鈴薯晚疫病的田間防治結(jié)果

3 結(jié)論與討論

山蒼子油作為植物源農(nóng)藥已經(jīng)在殺蟲方面取得很明顯的效果[12]。吳均等[13]研究也證實(shí)，山蒼子油在對細(xì)菌和真菌的防控上極具潛力。2013年，吳克剛等[14]研究了幾種植物精油對銅綠假單胞菌的抗菌作用。其中，山蒼子精油和香茅精油對銅綠假單胞菌具有較好的抑菌活性，最低抑菌量達(dá)到250 μL/L，且山蒼子精油和香茅精油復(fù)配比為2∶3和3∶2時(shí)能夠呈現(xiàn)出協(xié)同增效效果。2014年，李鳳清[15]研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子精油對青霉、黑曲霉和酵母均有較好的抑菌活性，最低抑菌體積分?jǐn)?shù)為1.49%～2.97%，最低殺菌體積分?jǐn)?shù)為1.49%～5.94%。2014年，陳瑤等[16]研究表明，山蒼子油對茶樹炭疽病菌的EC50為142.79 mg/L，且與茶皂素配比具有增效作用。對比之下，本研究所使用的25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的EC50為94.126 5 mg/L，同樣具有很好的抑菌活性。。

植物提取物對馬鈴薯晚疫病菌的抑菌作用早有研究，但能夠達(dá)到良好抑菌效果的提取物濃度較高。2006年，王樹桐等[17]研究結(jié)果表明，知母水提取物對馬鈴薯晚疫病菌菌絲生長的EC50為1.91×103mg/L。該課題組還研究了芒果苷對馬鈴薯晚疫病菌生長的抑制作用，其EC50為100.97 mg/L[18]。2007年，閔凡祥等[19]研究了苦參、瑞香狼毒等4種植物提取物對馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用，4種提取物對馬鈴薯晚疫病菌都有明顯的抑制作用，室內(nèi)毒力最強(qiáng)的苦參醇萃取物EC50為1.77×104mg/L。25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的抑制中濃度為94.126 5 mg/L，抑菌濃度較低，抑菌有效性更高。

良好的田間防效對提高馬鈴薯產(chǎn)量和品質(zhì)起到了重要作用。因此，該藥劑具有推廣意義。NGUYEN等[8]研究發(fā)現(xiàn)，山蒼子油暴露于空氣中2 h后即可發(fā)揮出強(qiáng)烈的抑菌作用，揮發(fā)時(shí)間對其抑制細(xì)菌生長的作用產(chǎn)生影響，山蒼子油揮發(fā)時(shí)間越長，抑菌效果也越弱。建議針對當(dāng)?shù)赝硪卟“l(fā)生情況以及施藥前后的天氣情況，對藥劑噴施方法適當(dāng)進(jìn)行改良，把握好施藥的關(guān)鍵時(shí)期，使防控效果更加明顯，同時(shí)，對藥劑噴施的時(shí)間、次數(shù)和用量進(jìn)行合理把控。

殺菌劑的長期使用可能會因在農(nóng)產(chǎn)品和動(dòng)物制品中的富集而導(dǎo)致威脅人類健康的問題[20]。有研究表明，對卵菌病害有效的本酰胺類化合物，由于其主要作用于二倍體致病菌而易使病原菌產(chǎn)生由單個(gè)主效基因控制的抗性因子[21]。植物源農(nóng)藥復(fù)雜的成分和作用機(jī)制，能夠在病害的防治過程中減少這種情況的發(fā)生。

植物源農(nóng)藥的提取物質(zhì)具有復(fù)雜的活性成分，其作用位點(diǎn)也極具多樣性，同一物質(zhì)對不同病原菌的作用機(jī)制和抑制方式也經(jīng)常不同。周翠等[21]對1株芽孢桿菌的揮發(fā)物質(zhì)與不同病原菌的互作進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該揮發(fā)物質(zhì)對不同病原菌的作用機(jī)制和作用方式不同，對葡萄白腐病菌的作用機(jī)制是使菌絲分支增多，對楊樹腐爛病菌是使菌絲變粗，對合歡枯萎病菌則是使菌絲變細(xì)。山蒼子油中具體哪些成分對馬鈴薯晚疫病菌具有抑制效果目前還不清楚，但已有研究表明，山蒼子油中的主要成分檸檬醛及其衍生物對多種真菌菌絲生長及產(chǎn)孢等均具有良好的抑制效果[22]，其抑菌機(jī)制也值得進(jìn)一步探索。

本試驗(yàn)進(jìn)行了25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的室內(nèi)平板抑菌試驗(yàn)和田間防效研究，結(jié)果表明，25%山蒼子油EW制劑對馬鈴薯晚疫病菌表現(xiàn)出良好的防效。在室內(nèi)毒力測定試驗(yàn)中，25%山蒼子油EW對馬鈴薯晚疫病菌的EC50為94.126 5 mg/L，田間防效達(dá)到75.00%。雖然防治效果稍遜于銀法利，但由于其是純天然制劑，能減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境造成的不良影響，對其進(jìn)行研究和開發(fā)，可為防治馬鈴薯晚疫病探尋新的途徑。