謝麗華，藺曉源，何 飄，劉 瑛，胡國(guó)恒*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007)

新型冠狀病毒肺炎（Coronavirus Disease 2019，COVID-19）是一種由2019 新型冠狀病毒（SARSCoV-2）感染引起的流行性肺炎，其傳染性強(qiáng)，人群普遍易感，臨床癥狀以發(fā)熱、乏力、干咳為主，嚴(yán)重者并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征。針對(duì)COVID-19，西醫(yī)主要以抗感染、對(duì)癥支持治療為主[1]，中醫(yī)藥作為祖國(guó)醫(yī)學(xué)的寶貴遺產(chǎn)，在治療與預(yù)防疫病方面具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，在整體觀念及辨證論治思想的指導(dǎo)下，可通過驅(qū)邪外出、扶助正氣實(shí)現(xiàn)整體調(diào)節(jié)，以改善臨床癥狀、延緩疾病發(fā)展。

2020 年1 月31 日，中國(guó)科學(xué)院初步發(fā)現(xiàn)雙黃連口服液可抑制SARS-CoV-2，雙黃連口服液由金銀花、黃芩、連翹3 味中藥組成，具疏風(fēng)解表、清熱解毒之效。 金銀花、連翹疏散風(fēng)熱、清熱解毒，配以苦寒之黃芩以清中上焦?jié)駸?、瀉上焦實(shí)火，主要用于以發(fā)熱、咳嗽、咽痛為主的外感風(fēng)熱之癥，對(duì)病毒感染所致的上呼吸道感染、肺炎等具有一定療效[2]。 研究表明，雙黃連口服液可通過減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、抑制病毒復(fù)制，減輕肺損傷，對(duì)流感病毒（H1N1、H5N1）、呼吸道合胞病毒、輪狀病毒具有明顯的抗病毒效應(yīng)[3-6]。劉菊等[7]通過總結(jié)中藥抗病毒及抗COVID-19 臨床推薦用藥的研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒中藥使用頻率前5 的為金銀花、板藍(lán)根、魚腥草、連翹、黃芩，中醫(yī)藥防治COVID-19 推薦用藥多含金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃連、黃芪、人參等，而在多次COVID-19 臨床診療方案中并未推薦雙黃連制劑。故本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)雙黃連口服液主要化學(xué)成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行功能及通路富集分析，預(yù)測(cè)雙黃連口服液防治COVID-19的有效成分及潛在作用機(jī)制，并采用分子對(duì)接的方法，對(duì)主要活性成分與SARS-CoV-23CL 水解酶（Mpro）、ACE2、2019-nCoV RBD/ACE2-B0AT1complex進(jìn)行篩選，為尋找COVID-19 的藥物治療或新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）；DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://david.ncifcrf.gov/）；RCSBPDB 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.rcsb.org/）；Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）；PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）；CTD 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://ctdbase.org/）；BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://biogps.org/#goto=welcome）；Venny 2.1 在線軟件作圖工具平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）；在線繪圖平臺(tái)Omicshare（https://www.omicshare.com/）；Chemoffice 軟 件；AutoDockVina1.1.2 軟 件；PyMOL 軟 件；Cytoscape 3.6.1 軟 件；GraphPad Prism 8 軟件。

1.2 方法

1.2.1 雙黃連口服液化學(xué)成分的收集 以“金銀花”“黃芩”“連翹”為關(guān)鍵詞通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索其成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、藥物相似性（drug-likeness， DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)確定化學(xué)成分，使用Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載化學(xué)成分的分子結(jié)構(gòu)并保存各成分的Canonical SMILES 格式。

1.2.2 雙黃連口服液靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 將SMILES 格式導(dǎo)入Swiss 數(shù)據(jù)庫(kù)，以“人類”為研究對(duì)象，得到相應(yīng)化學(xué)成分的作用靶點(diǎn)，整合去除重復(fù)后得到雙黃連口服液的作用靶點(diǎn)。

1.2.3 COVID-19 靶點(diǎn)的獲取 使用GeneCards、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)，以"novel coronavirus"為關(guān)鍵字進(jìn)行搜索，每個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)選擇相關(guān)度前300 的靶點(diǎn)作為COVID-19 的相關(guān)作用靶點(diǎn)[8]，整合去除重復(fù)后得到COVID-19 作用靶點(diǎn)。

1.2.4 潛在作用靶點(diǎn)的獲取 將雙黃連口服液靶點(diǎn)及COVID-19 靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venny 2.1 在線作圖工具平臺(tái)，繪制韋恩圖，得到兩者的交集，即為雙黃連口服液抗COVID-19 的潛在作用靶點(diǎn)，即成分-疾病靶點(diǎn)。

1.2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將化學(xué)成分及所得到的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件， 構(gòu)建雙黃連口服液抗COVID-19 的“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer 功能對(duì)藥物中的化學(xué)成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分析，節(jié)點(diǎn)大小顏色深淺代表度（degree）值的大小，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值篩選主要活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)錄入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取蛋白相互作用信息，運(yùn)用Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行可視化分析，并通過BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行組織定位分析，得到其作用組織。

1.2.6 通路富集分析 將成分-疾病靶點(diǎn)以Gene Symbol 的格式導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，分別選擇生物過程（biological process， BP）、分子功能（molecular function， MF）和細(xì)胞成分（cellular component， CC）進(jìn)行基因本體（GO）富集分析，選擇KEGG 進(jìn)行靶點(diǎn)基因通路注釋分析，并且使用GraphPad Prism 8 軟件將GO 富集分析滿足P＜0.05 的結(jié)果做成可視化條形圖。 使用Omicshare 平臺(tái)將KEGG 分析滿足P＜0.05 的結(jié)果制成可視化氣泡圖。

1.2.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 將主要活性成分的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Chemoffice 軟件對(duì)其進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)能量?jī)?yōu)化，保存；應(yīng)用RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(kù)下載SARS-CoV-2 3CLMpro（PDB ID：6LU7）、ACE2（PDB ID：1R42）、2019-nCoVRBD/ACE2-B0AT1complex（PDB ID：6M17）的晶體結(jié)構(gòu)，運(yùn)用Mgltools 1.5.6 進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷后保存為*pdbqt 文件，選擇3CLMpro、ACE2、complex 特有的小分子配體作為活性中心，最后運(yùn)用AutoDockVina 對(duì)其進(jìn)行分子對(duì)接，利用Pymol 進(jìn)行分析作圖。

2 結(jié)果

2.1 潛在化學(xué)成分

根據(jù)OB≥30%，DL≥0.18，通過TCMSP 檢索到雙黃連口服液中3 味中藥去除重復(fù)的化學(xué)成分后共74 個(gè)，金銀花23 個(gè)，黃芩36 個(gè)，連翹23 個(gè)，其中，漢黃芩素為黃芩、連翹所共有，豆甾醇、黃烷酮為黃芩、金銀花所共有，槲皮素、木犀草素、山奈酚為連翹、金銀花所共有，β-谷甾醇為3 者共有。 研究表明，金銀花中的齊墩果酸、木犀草苷、異綠原酸A 和連翹中的連翹酯苷具有潛在的抗SARS-CoV-2 作用[9]，雖然這些成分不滿足OB≥30%，DL≥0.18 的標(biāo)準(zhǔn)，亦納入研究，故共收集到78 個(gè)化學(xué)成分。

2.2 抗COVID-19 潛在作用靶點(diǎn)

將Swiss 數(shù)據(jù)庫(kù)中得到的化學(xué)成分作用靶點(diǎn)去重復(fù)后得到629 個(gè)靶點(diǎn)，中藥-成分-靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)見圖1。通過Genecards、CTD 數(shù)據(jù)庫(kù)查找COVID-19 相關(guān)作用靶點(diǎn)，去重復(fù)后得到330 個(gè)。將化學(xué)成分潛在作用靶點(diǎn)及疾病相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1 在線作圖工具平臺(tái)，繪制韋恩圖，見圖2，共得到兩者交集靶點(diǎn)72 個(gè)，表明雙黃連口服液可能通過調(diào)節(jié)多個(gè)潛在靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

2.3 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將雙黃連口服液化學(xué)成分與72 個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1 軟件，除去無靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)的孤立成分，繪制中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖3。 使用Network Analyzer 功能對(duì)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，度值代表該成分與潛在靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)數(shù)，度值越大表明該成分在疾病網(wǎng)絡(luò)中越重要，根據(jù)度值篩選活性成分，其中7-O-甲基漢黃芩素、1，2-苯二甲酸二(2-乙基己基)酯、刺槐素、漢黃芩素、黃芩素、5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮、鼠尾草素、去甲漢黃芩素、5，2'-二羥基-6，7，8-三甲氧基黃酮、金圣草素、千層紙素A、黃芩黃酮、黃烷酮、木犀草素等14 個(gè)成分度值均大于成分度值中位數(shù)（成分度值中位數(shù)=13），且均能與18 個(gè)及以上靶點(diǎn)相關(guān)聯(lián)，預(yù)測(cè)這14 個(gè)成分是雙黃連口服液抗COVID-19 的主要活性成分。

2.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及組織定位分析

根據(jù)靶點(diǎn)度值≥2 倍中位數(shù)（靶點(diǎn)度值=4）篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)[10]，得到PTGS2、SRC、MMP2、EGFR、APP等28 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，將關(guān)鍵靶點(diǎn)錄入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)得到蛋白之間相互作用關(guān)系，并導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖4。PTGS2 為前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶的一種亞型，其主要產(chǎn)物前列腺素對(duì)RNA 病毒、DNA 病毒均有抗病毒活性，可在病毒復(fù)制的早期抑制細(xì)胞中的病毒復(fù)制[11]。 SRC 蛋白激酶在多種病毒感染過程中被激活并在病毒復(fù)制、侵襲過程中具有重要作用[12-13]。EGFR 是受體酪氨酸激酶（RTKs）家族成員之一，其可介導(dǎo)病毒入侵，并在病毒延長(zhǎng)存活時(shí)間及逃避宿主免疫監(jiān)控等過程發(fā)揮重要作用[14]。

為明確雙黃連口服液發(fā)揮抗病毒功效與人體組織之間的關(guān)系，將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入BioGPS 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定位，見圖4，其中，各組織類型分別為呼吸系統(tǒng)的肺及氣管，消化系統(tǒng)的胃腸，神經(jīng)系統(tǒng)的腦，免疫系統(tǒng)的血小板、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，不同顏色代表對(duì)應(yīng)不同的組織。由圖可知，13 個(gè)靶點(diǎn)作用于肺組織，為最多，依次為大腦10 個(gè)，T 細(xì)胞9 個(gè)，胃腸8 個(gè)，血小板8 個(gè)，中性粒細(xì)胞6 個(gè)，B細(xì)胞5 個(gè)，漿細(xì)胞3 個(gè)。表明雙黃連口服液活性成分抗COVID-19 的關(guān)鍵基因主要在肺組織和免疫細(xì)胞中表達(dá)。

2.5 GO 富集分析及KEGG 通路注釋分析

將72 個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO富集分析（P＜0.05），共得到169 個(gè)條目，包含121 個(gè)生物過程，23 個(gè)細(xì)胞成分，25 個(gè)分子功能，見圖5。生物過程主要涉及分解代謝、RNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控、血管再生、IL-6 的表達(dá)與調(diào)控等；在細(xì)胞成分中，主要涉及細(xì)胞溶質(zhì)、胞外基質(zhì)、溶酶體、RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；分子功能主要包括ATP 結(jié)合、血紅素結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等。KEGG 分析（P＜0.05）共富集到100 條信號(hào)通路，見圖6，主要集中在癌癥相關(guān)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）、雌激素信號(hào)通路（Estrogen signaling pathway）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等（TNF signaling pathway）等，可見上述生物功能及信號(hào)通路可能與雙黃連口服液治療COVID-19 密切相關(guān)。

2.6 主要活性成分的分子對(duì)接驗(yàn)證

圖4 關(guān)鍵基因PPI 篩選網(wǎng)絡(luò)及組織定位分析圖

一般結(jié)合能小于0 說明配體可與受體自發(fā)結(jié)合，目前對(duì)于活性分子靶點(diǎn)篩選尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，此處選取結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol 作為活性分子與SARS-CoV-2 存在較強(qiáng)結(jié)合活性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[15]。研究表明，SARS-CoV-2 與SARS-CoV 感染途徑均通過其表達(dá)的S-蛋白與人體內(nèi)ACE2 相結(jié)合構(gòu)成SARS-CoV-2-RBD-ACE2 復(fù)合物，再通過S蛋白膜融合作用釋放病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[16]。SARS-CoV-2 屬于RNA 病毒，3CLMpro 在其復(fù)制過程中發(fā)揮重要作用[17]，影響3CLMpro、ACE2 結(jié)合活性或影響病毒與ACE2 結(jié)合復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性干擾病毒感染宿主細(xì)胞及復(fù)制過程，可能是抑制SARS-CoV-2 感染人體的方式[18]。 故將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中度值前14 的活性成分與3CLMpro、ACE2 及2019-nCoVRBD/ACE2-B0AT1 complex 進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表1 及圖7。 結(jié)果顯示，14 個(gè)主要活性成分與3CLMpro、ACE2 及complex 結(jié)合能均＜-5.0 kcal/mol，可知雙黃連口服液主要活性成分與這3 個(gè)蛋白結(jié)合構(gòu)象能量低，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有較好的結(jié)合能力。

圖6 潛在靶點(diǎn)KEGG 通路注釋分析氣泡圖

3 討論

表1 雙黃連口服液主要活性成分的結(jié)合能

自推行中西醫(yī)結(jié)合治療COVID-19 后，我國(guó)疫情逐漸被控制下來，而中醫(yī)藥發(fā)揮至關(guān)重要的作用，數(shù)據(jù)表明，中西醫(yī)結(jié)合治療臨床治愈率（91.2%）較單純西醫(yī)治療（61.1%）有明顯提高[19-20]。 根據(jù)此次疫情發(fā)生的特點(diǎn)，COVID-19 屬于中醫(yī)學(xué)“疫病”范疇，“寒濕疫毒”為其重要病因[21]?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝自\療方案（試行第三版）》[22]將COVID-19 分為寒濕郁肺、邪熱壅肺、邪毒閉肺、內(nèi)閉外脫4 類，治以化濕解毒、宣肺透邪，或清熱解毒、宣肺透邪，或宣肺解毒、通腑泄熱，或開閉固脫、解毒救逆。雙黃連口服液具疏風(fēng)解表、清熱解毒之效，可明顯降低邪熱壅肺型支氣管肺炎患者血象及降鈣素原等感染指標(biāo)，改善患者發(fā)熱、咳嗽、氣急及肺部啰音等癥狀及體征[23]。目前，雙黃連口服液廣泛用于流感、肺炎的臨床治療[24-25]。 雖在多次修訂的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》 中并沒有明確推薦雙黃連口服液治療，但通過對(duì)全國(guó)各地區(qū)治療COVID-19 的中藥數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，金銀花、黃芩、連翹使用次數(shù)較為頻繁[26]，因此其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的研究具有一定意義，也為COVID-19 的中醫(yī)藥治療提供參考。

圖7 分子對(duì)接熱圖和黃芩素、黃烷酮、木犀草素與3CLMpro、ACE2、complex 分子對(duì)接模式

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行研究，共得到雙黃連口服液化學(xué)成分78 個(gè)，化學(xué)成分靶點(diǎn)629 個(gè)，COVID-19 相關(guān)靶點(diǎn)330 個(gè)，最終得到化學(xué)成分-疾病靶點(diǎn)72個(gè)。 對(duì)成分-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析發(fā)現(xiàn)，雙黃連口服液活性成分可參與RNA 轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄因子活性、IL-6 的表達(dá)與調(diào)控、ATP 結(jié)合、血紅素結(jié)合等生物功能發(fā)揮抗COVID-19 作用。 研究表明，SARS-CoV-2 屬于RNA 病毒，RNA 轉(zhuǎn)錄可調(diào)控其復(fù)制增殖過程[17]。 黃芩素、木犀草素可抑制H5N1病毒復(fù)制，并可干擾N5N1 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6、TNFα 產(chǎn)生[27]。IL-6 是一種促炎性因子，是形成細(xì)胞因子風(fēng)暴中的關(guān)鍵因素，在加速COVID-19 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[28]。 黃芩苷可明顯降低IL-6、TNF-γ等細(xì)胞因子抑制炎癥反應(yīng)[29]，連翹可通過降低核因子-κB（NF-κB）、Toll 樣受體4（TLR4）表達(dá)水平，減少IL-10、IL-6 等細(xì)胞因子分泌，發(fā)揮抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用[30]。血紅素為鐵卟啉化合物，是血紅蛋白的輔基，其可與氧結(jié)合參與機(jī)體載氧、貯氧過程，當(dāng)組織得不到充足的氧，或不能充分利用氧時(shí)，則可導(dǎo)致機(jī)體缺氧，嚴(yán)重COVID-19 患者可見呼吸困難和低氧血癥，其發(fā)生機(jī)制可能與IL-2、IL-10、TNF 等誘發(fā)炎癥反應(yīng)，缺氧誘發(fā)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，進(jìn)而引起彌漫性肺泡損傷、肺水腫，導(dǎo)致呼吸困難，甚至引發(fā)急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）[31]有關(guān)。黃芩苷可下調(diào)百草枯中毒大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGFβ1）、HIF-1α 表達(dá)，改善肺纖維化及缺氧癥狀[32]。

KEGG 通路注釋分析結(jié)果顯示，雙黃連口服液主要通過調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)通路、HIF-1、PI3K-Akt、TNF信號(hào)通路等途徑來干預(yù)COVID-19。 HIF-1 通路主要通過調(diào)控ROS 產(chǎn)生、能量代謝、線粒體呼吸等過程參與機(jī)體缺氧反應(yīng)[33]，去甲漢黃芩素可降低缺氧細(xì)胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生，下調(diào)HIF-1α、Caspase-3 表達(dá)，增加Bcl-2 表達(dá)水平，保護(hù)細(xì)胞膜完整性[34]。 TNF 信號(hào)通路主要與炎癥反應(yīng)相關(guān)，金銀花提取物可抑制H1N1 病毒核酸RNA 表達(dá)，抑制病毒復(fù)制，還可降低TNF-α、IL-1β 水平抑制炎癥反應(yīng)[35]。 PI3K/Akt 通路可調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡、能量代謝等過程，還參與調(diào)節(jié)TNF-α 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)及ROS 介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[36-37]。黃芩苷可抑制PI3K/Akt 通路激活，抑制NF-κB 轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少TNF-α、IL-6 等細(xì)胞因子的分泌，發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)作用[38]。連翹苷可通過調(diào)控NF-κB 通路以抑制IL-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[39]。因此，雙黃連口服液活性成分可能通過干預(yù)癌癥相關(guān)通路、HIF-1、PI3K-Akt 及TNF 信號(hào)通路，發(fā)揮抗病毒、抗炎、抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡作用，從而達(dá)到治療COVID-19 的目的。

PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建發(fā)現(xiàn)干預(yù)COVID-19 的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要為PTGS2、SRC、MMP2、EGFR、APP 等28 個(gè)。進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行組織定位分析，可知其基因主要映射在肺組織和免疫細(xì)胞中。SARS-CoV-2 感染早期主要通過與肺中氣道上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)的ACE2 結(jié)合而侵入機(jī)體[40-41]。SARS-CoV-2 感染和肺組織損傷可觸發(fā)免疫反應(yīng)，募集巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，誘發(fā)T 細(xì)胞免疫反應(yīng)及B 細(xì)胞免疫反應(yīng)[31]，可見肺組織及免疫細(xì)胞較易受累。 PTGS2 主要產(chǎn)物是前列腺素（PG），黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等黃酮類化合物可通過抑制脂多糖（LPS）激活的小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)PGE2 的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用[42]。木犀草素可抑制PI3K/Akt 通路激活，減少直腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠肺組織中MPP9 表達(dá)[43]。連翹可以抑制H1N1 肺炎小鼠模型中促炎細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞等）釋放TNF、IL-6 等細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎作用[44]。 黃芩素可顯著抑制免疫細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）的釋放，抑制PARP1 激活，保護(hù)線粒體功能，減少細(xì)胞凋亡[45]。

通過構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，雙黃連口服液活性成分主要有木犀草素、千層紙素A、黃芩素、漢黃芩素、黃芩黃酮等14 個(gè)，該14 個(gè) 成 分 均能與SARS-CoV-2 3CLMpro、ACE2 及2019-nCoVRBD/ACE2-B0AT1 complex 結(jié)合，表明雙黃連口服液對(duì)COVID-19 具有一定的潛在治療作用。其中，黃芩素、黃烷酮、木犀草素與3CLMpro結(jié)合能力較好，而3CLMpro 抑制劑可有效阻斷病毒復(fù)制；金圣草素、黃芩素、黃烷酮、木犀草素和ACE2 具有較好的結(jié)合能力，可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ACE2，抑制SARSCoV-2 感染宿主細(xì)胞；5，7，4'-三羥基-8-甲氧基黃酮、去甲漢黃芩素、黃芩素、黃芩黃酮與complex 有較好的結(jié)合能力，可影響SARS-CoV-2 S 蛋白受體與ACE2 結(jié)合復(fù)合物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以抑制病毒核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞。結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果，黃芩素、黃烷酮、木犀草素與3 個(gè)蛋白結(jié)合能均較低，且與瑞德西韋及《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第7 版）》[46]中推薦的利托那韋、洛匹那韋具有相似的結(jié)合能力。 黃芩素、木犀草素等黃酮類化合物可通過抑制病毒復(fù)制、降低細(xì)胞因子產(chǎn)生發(fā)揮抗病毒作用[27]，故推測(cè)黃芩素、黃烷酮、木犀草素可能在抗SARSCoV-2 中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，通過對(duì)雙黃連口服液中化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)及其主要活性成分與3CLMpro、ACE2、complex 結(jié)合能力進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)研究，可以發(fā)現(xiàn)雙黃連口服液可通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同發(fā)揮抗COVID-19 的作用。 然而，“整體觀念、辨證論治”是中醫(yī)診治疾病的基本特點(diǎn)，臨證處方之時(shí)還需考慮患者體質(zhì)陰陽偏盛之別、發(fā)病地域寒溫之異、病情發(fā)展階段不同等情況因證施治。雙黃連為苦寒清解之品，易損傷脾胃，易耗傷人體陽氣，故不可盲目服用。且根據(jù)2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》[47]，黃芩苷、綠原酸、連翹苷為雙黃連口服液的質(zhì)量控制成分，在制備過程由于成分的富集及丟失，致黃芩素、黃烷酮、木犀草素等含量較低，故雙黃連口服液抑制SARS-CoV-2 具有一定限制性。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接技術(shù)本身具有一定的局限性，其預(yù)測(cè)的結(jié)果還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其有效性，為防治COVID-19 及藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。