孫 濤，李 雅*，郭志華，，龍 云，曾 英，王 月

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

隨著多數(shù)心血管疾病得到良好的診治，慢性心力衰竭(chronic heart failure， CHF)所帶來(lái)的問(wèn)題越來(lái)越突出，現(xiàn)已成為人類健康道路上最大的敵人之一，絕大多數(shù)心血管疾病發(fā)展到終末期都會(huì)并發(fā)心力衰竭。 研究表明，心室重構(gòu)在心力衰竭發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程中扮演重要角色[1]。 而β-arrestin 的偏向激活作用在心室重構(gòu)中的發(fā)揮也得到了越來(lái)越多的關(guān)注。 近期研究證實(shí)，成功抑制β-arrestin 介導(dǎo)的p38MAPK 信號(hào)通路對(duì)心肌有保護(hù)作用[2]。 中藥復(fù)方益心泰長(zhǎng)期應(yīng)用于慢性心力衰竭患者的臨床治療，且療效已得到充分肯定[3-6]。本課題組前期研究已經(jīng)證明，益心泰能夠通過(guò)抑制G 蛋白偶聯(lián)受體，延緩心力衰竭[7]，但是否能夠抑制β-arrestin 介導(dǎo)的p38MAPK 信號(hào)通路尚不清楚。本研究通過(guò)觀察益心泰對(duì)慢性心力衰竭大鼠心室重構(gòu)時(shí)β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)的影響，試圖闡明益心泰抗心室重構(gòu)的多重作用機(jī)制，為將其應(yīng)用于臨床提供充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 大鼠60 只，雄性，清潔級(jí)，體質(zhì)量200～230 g，由湖南省人民醫(yī)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002。

1.2 藥物、試劑與儀器設(shè)備：

益心泰由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中成藥制劑中心提供的醫(yī)院制劑，主要由黃芪、紅花、豬苓等組成；卡維地洛由山東齊魯制藥有限公司提供(批號(hào)：201800035)，商品名：金絡(luò)，10 mg/片；β-arrestin蛋白表達(dá)試劑盒（湖南玉堂生物試劑公司）；兔抗鼠p38MAPK 抗體(北京博奧森公司)；AEV-210 電子分析天平(長(zhǎng)沙湘儀天平儀器廠)；Vivid 7.0 彩色超聲儀（美國(guó)GE 公司）；UV-365 型紫外分光光度計(jì)(日本島津)。

1.3 模型制備與動(dòng)物分組

60 只清潔級(jí)SD 雄性大鼠中，隨機(jī)數(shù)字表法選取10 只設(shè)正常對(duì)照組，其余50 只采用腹腔注射鹽酸阿霉素法建立心衰大鼠模型[8]，按第1 次和第2次1.0 mg/（kg·d）劑量給藥，第3 次和第4 次2.0 mg/（kg·d）劑量給藥，第5 次和第6 次1.0 mg/（kg·d）劑量給藥，第7 次和第8 次2.0 mg/（kg·d）劑量給藥，累積劑量12 mg/kg，隔天注射，共計(jì)15 d，觀察大鼠表征及行為改變。 于第16 天完成心臟彩超檢查，以左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)為參考指標(biāo)，數(shù)值低于40%作為心力衰竭模型成功的標(biāo)志，同時(shí)大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、活動(dòng)減少、精神萎靡、毛色黯淡無(wú)光澤，列入觀察對(duì)象。在符合上述標(biāo)準(zhǔn)的大鼠中，隨機(jī)選取30 只，再隨機(jī)分為3 組：益心泰組2.0 g/（10 mL·kg)；卡維地洛組10 mg/（10 mL·kg)；正常對(duì)照組及模型組(生理鹽水等容積)，各組均為每日給藥1 次，連續(xù)灌胃給藥8 周，觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠一般情況。給藥8周后，檢測(cè)大鼠心室重構(gòu)指標(biāo)及β-arrestin、p-p38MAPK蛋白表達(dá)情況。

1.4 各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 左室結(jié)構(gòu)觀測(cè) 采用Vivid 7.0 彩色超聲儀進(jìn)行檢測(cè)。 分別取胸骨旁左室長(zhǎng)軸切面和心尖兩腔心切面，由二維超聲引導(dǎo)M 型曲線并進(jìn)行測(cè)量。 測(cè)量指標(biāo)為左心室后壁厚度（posterior Wall thicknessin diastole， PWD）、室間隔厚度(interventricular septal thickness at end diastole， IVSD)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic dimension，LVEDD)、左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular end-systolic dimension， LVESD)，均 記 錄 連 續(xù)3 個(gè) 心 動(dòng) 周 期 數(shù)值，再取平均值。

1.4.2 心室重構(gòu)指標(biāo)檢測(cè) 左心室重量指數(shù)(left ventricular weight index， LVWI) 和右心室重量指數(shù)(right ventricular weight index， RVWI)，左心室濕重/體重即左心室重量指數(shù)；右心室濕重/體重即右心室重量指數(shù)[9]。

1.4.3 Western blot 檢測(cè)β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達(dá) 采用Western blot 檢測(cè)β-arrestin、p-p38MAPK蛋白的相對(duì)表達(dá)，洗膜后用GE AI600 多功能成像儀掃描條帶，并用Gel-Pro Analyzer 4.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 即認(rèn)為檢驗(yàn)的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果以“±s”表示，先行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，若滿足正態(tài)性及方差齊性，行單因素方差分析；若不滿足采用非參數(shù)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 左室結(jié)構(gòu)變化情況比較

與正常對(duì)照組比較，模型組左室后壁、室間隔厚度明顯降低，左心室舒張末期內(nèi)徑及收縮末期內(nèi)徑均明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組進(jìn)行比較，益心泰組、卡維地洛組左室后壁、室間隔厚度增加，左心室舒張末期內(nèi)徑及收縮末期內(nèi)徑減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；益心泰組與卡維地洛組各項(xiàng)指標(biāo)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖1 和圖2。

圖1 各組室間隔及左室后壁厚度變化情況

圖2 各組左室舒張末內(nèi)徑及收縮末內(nèi)徑變化情況

2.2 心室重構(gòu)指標(biāo)變化情況

與正常對(duì)照組比較，模型組左、右心室重量指數(shù)明顯增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組左、右心室重量指數(shù)均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，益心泰組與卡維地洛組各項(xiàng)指標(biāo)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)圖3。

圖3 各組左右心室質(zhì)量指數(shù)變化情況

2.3 β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)情況

與正常對(duì)照組比較，模型組β-arrestin 蛋白表達(dá)明顯下降，p-p38MAPK 蛋白表達(dá)顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；與模型組比較，益心泰組、卡維地洛組β-arrestin 蛋白表達(dá)增加，p-p38MAPK蛋白表達(dá)減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；益心泰組與卡維地洛組各項(xiàng)指標(biāo)組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 各組β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)情況

3 討論

前期研究表明，β-arrestin 蛋白家族屬于一種腳手架蛋白，多種信號(hào)蛋白可以被它募集，根據(jù)募集蛋白的不同，β-arrestin 會(huì)調(diào)節(jié)7 次跨膜受體，產(chǎn)生不同的效應(yīng)，如去磷酸化、泛素化、反式激活等[10]。隨著研究的深入，β-arrestin 越來(lái)越多的作用被發(fā)現(xiàn)，它作為腳手架蛋白的同時(shí)也是一類信號(hào)分子，且不依賴于G 蛋白；β-arrestin 亦屬于接頭蛋白，可以與體內(nèi)多種激酶與目標(biāo)蛋白相互作用；β-arrestin 能夠激活表皮生長(zhǎng)因子，并在此過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。 由于其作用靶點(diǎn)多樣，功能豐富，已經(jīng)成為藥物研發(fā)的新目標(biāo)。 同時(shí)，p38MAPK 作為β-arrestin 的下游重要靶點(diǎn)，也受到越來(lái)越多的關(guān)注。 p38MAPK 廣泛分布于人體細(xì)胞內(nèi)，且可被多種因素激活，例如輻射、炎癥、缺氧、細(xì)胞因子等[11-12]。 p38MAPK 的激活與心力衰竭的發(fā)生有著明確關(guān)系，研究已證明p38MAPK磷酸化后誘發(fā)心力衰竭的主要機(jī)制是啟動(dòng)心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘發(fā)心室重構(gòu)[13-15]。 本研究已經(jīng)證明益心泰和卡維地洛對(duì)大鼠心室重構(gòu)有顯著的抑制作用，如圖1、2 所示兩治療組均改善了左室結(jié)構(gòu)，降低了左、右心室重量指數(shù)。 從圖3 可知，益心泰組和卡維地洛組β-arrestin 蛋白表達(dá)增加，p-p38MAPK 蛋白表達(dá)減少，與模型組及正常對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 綜上結(jié)果可知，益心泰抑制心室重構(gòu)作用顯著，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)的β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

心力衰竭臨床上以呼吸困難、水腫、乏力等癥狀為主要表現(xiàn)，在中醫(yī)學(xué)中屬“喘證”“水腫”“虛證”等范疇。 其共同病機(jī)為“本虛標(biāo)實(shí)”，又以氣虛為主，氣虛則血虛，氣虛則血瘀，氣虛則水停。 益心泰是遵從上述理論指導(dǎo)，結(jié)合導(dǎo)師多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而成的中藥復(fù)方，由黃芪、紅花、豬苓等藥物組成，該復(fù)方主要針對(duì)的病機(jī)是氣虛血瘀水停。方中黃芪用量最重，為君藥，可補(bǔ)氣之不足；紅花為臣藥，活血化瘀，因其入心經(jīng)，在本方中兼作使藥；豬苓為佐藥，利水消腫，配合余藥，共奏益氣活血利水之功。

綜上所述，本研究表明益心泰有效調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)的β-arrestin、p-p38MAPK 蛋白表達(dá)，從而明顯抑制心室重構(gòu)。但β-arrestin 介導(dǎo)的p38MAPK 信號(hào)通路作用機(jī)制具有多樣性，且步驟非常復(fù)雜，仍需進(jìn)一步深入研究。