彭 俊，蔣鵬飛，王 英，劉家琪，潘 坤，周亞莎，徐 劍*，彭清華，3*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.中醫(yī)藥防治眼耳鼻咽喉疾病湖南省重點實驗室，湖南 長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa， RP）是一種遺傳性視網(wǎng)膜病，臨床特征是雙眼發(fā)病，慢性進行性視力損害并伴有眼底色素變化[1]。 這種遺傳病理生理學(xué)的多樣性使得治療極具挑戰(zhàn)性。 我國RP 患病率約為1/4 000，全球約有150 萬RP 患者[2]。雖然已經(jīng)使用各種藥理學(xué)試劑（神經(jīng)營養(yǎng)因子，抗氧化劑和抗凋亡劑）進行了治療嘗試，但大多數(shù)并未針對RP 的根本原因，并且其臨床療效尚未得到明確證實?；始彝饪茖W(xué)院(royal college surgeons， RCS)（rdy-/，p-/-）大鼠是較好的RP 動物模型，本研究以RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠為研究對象，從分子生物角度探討了枸杞子加丹參對RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠的干預(yù)效果。

1 材料

1.1 動物

SPF 級RCS 大鼠40 只，其中RCS(rdy-/-， p-/-）大鼠32 只，RCS（rdy+/+， p+/+）大鼠8 只，均雌雄各半。

1.2 藥品及試劑

枸杞子中藥配方顆粒（3.0 g 每袋，批號：5103761）、丹參中藥配方顆粒（1.8 g 每袋，批號：5100631），均由廣東一方制藥有限公司提供。Harris 蘇木素（上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，批號：71020784）、二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)公司，批號：zb-5301）、SDS（武漢默沙克生物有限公司，批號：kt40244）。

1.3 器材

輪轉(zhuǎn)石蠟切片機（徠卡，型號RM2235）、電泳儀（北京六一儀器廠，型號DYY-6C）、圖像分析系統(tǒng)（深圳市沅恒科技有限公司，型號：Motic 6.0）、臺式冷凍離心機（赫西儀器裝備有限公司，型號HR/T 16M）。

2 方法

2.1 分組

將40 只RCS 大鼠分為5 組，其中8 只RCS（rdy+/+， p+/+）大鼠為空白組，另32 只RCS（rdy-/-，p-/-）大鼠按照隨機數(shù)字表法分為模型組、枸杞組、丹參組、杞參組，每組8 只。

2.2 給藥方法

實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后給予灌胃，空白組、模型組大鼠以蒸餾水12 mL/kg 灌胃； 枸杞組將10 g 枸杞子中藥配方顆粒溶于50 mL 滅菌蒸餾水中（濃度為0.2 g/mL），最終以1.08 g/（kg·d）灌胃；丹參組將10 g 丹參中藥配方顆粒溶于40 mL 滅菌蒸餾水中（濃度為0.25 g/mL），最終以1.35 g/（kg·d）灌胃；杞參組將10 g 枸杞子及10 g 丹參溶于40 mL滅菌蒸餾水中（濃度為0.5 g/mL），最終以2.43 g/（kg·d）灌胃。 均灌胃28 d。

2.3 取材方法

灌胃結(jié)束1 d 后取材，麻醉動物后，仔細分離大鼠眼球周圍組織，徹底分離眼球周圍組織后，暴露眼球后方視神經(jīng)及筋膜組織，剪斷后取出眼球，放入4%多聚甲醛中固定，石臘包埋、切片，備行HE 染色與TUNNEL 染色。

2.4 指標檢測

2.4.1 HE 染色 經(jīng)二甲苯溶液脫蠟、無水乙醇洗蠟、乙醇浸泡、自來水洗、蘇木素染色、乙醇鹽酸分色、伊紅染色、乙醇分色脫水、二甲苯溶液透明、中性樹膠封片等步驟后，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化。

2.4.2 TUNEL 染色 經(jīng)烤片、脫蠟、蒸餾水浸洗、PBS 沖洗、染核等步驟后，90%甘油封片，在顯微鏡下觀察各組大鼠視網(wǎng)膜感光細胞凋亡情況，選取5個TUNEL 切片陽性細胞數(shù)最多的高倍視野(×400)，計算陽性細胞所占的百分比，即凋亡指數(shù)（apoptosis index， AI）。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 23.0 分析實驗數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以“±s”表示，多組比較用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HE 染色結(jié)果

空白組：大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列有序，形態(tài)規(guī)則。 模型組：大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜厚度變薄。枸杞組與丹參組：大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜厚度變薄。杞參組：視網(wǎng)膜厚度較模型組厚，感光細胞核數(shù)目較模型組多。 見圖1。

圖1 各組視網(wǎng)膜組織HE 染色結(jié)果（×400）

3.2 TUNEL 染色結(jié)果

3.2.1 各組視網(wǎng)膜組織TUNEL 染色圖片觀察 空白組：視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)規(guī)則，未見明顯感光細胞凋亡。 模型組：視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜見大量感光細胞凋亡。 枸杞組與丹參組：視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，視網(wǎng)膜見大量感光細胞凋亡。杞參組：視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)較規(guī)則，視網(wǎng)膜見少量感光細胞凋亡。 見圖2。

3.2.2 各組視網(wǎng)膜組織TUNEL 檢測感光細胞AI比較 各組灌胃后視網(wǎng)膜組織感光細胞AI 值比較：空白組低于模型組、枸杞組、丹參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），空白組與杞參組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；模型組與枸杞組、丹參組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），模型組高于杞參組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；枸杞組與丹參組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），枸杞組及丹參組均高于杞參組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 結(jié)果見表1、圖3。

圖2 各組視網(wǎng)膜組織TUNEL 染色結(jié)果（×400）

表1 各組視網(wǎng)膜組織TUNEL 檢測感光細胞AI 值比較（±s）

表1 各組視網(wǎng)膜組織TUNEL 檢測感光細胞AI 值比較（±s）

注：與空白組比較，◆P＜0.05；與模型組比較，◇P＜0.05；與枸杞組比較，P＜0.05；與丹參組比較，□P＜0.05

組別空白組模型組枸杞組丹參組杞參組n 8 8 8 8 8 AI/%11.39±4.69 24.38±9.62◆21.25±10.21◆19.25±7.98◆14.13±5.64◇□

圖3 灌胃后各組大鼠視網(wǎng)膜TUNEL 檢測感光細胞AI 值比較箱圖

4 討論

大多數(shù)RP 患者在青少年發(fā)病，視網(wǎng)膜病變通常從中周部開始，逐漸向后極部黃斑區(qū)進展，病情逐步進展，最終導(dǎo)致失明，嚴重影響生活和工作。 視網(wǎng)膜感光細胞死亡是RP 失明的原因，研究表明，視網(wǎng)膜感光細胞是通過細胞凋亡的方式死亡的[3-4]。

前期研究證實本虛標實、虛中夾瘀是RP 的基本病機，血瘀貫穿RP 病程始終[5-7]。RP 患者臨床多見虛中夾瘀證型，有陰虛夾瘀證，也有陽虛夾瘀證[8-10]。基于RP 的基本病機，彭清華教授提出了“補虛活血”法治療RP，藥用枸杞子、丹參[11]。 《本草綱目》記載枸杞子滋腎、潤肺、明目[12]。 枸杞子常用于肝腎虛弱所致各類眼科疾病，如黃斑變性、老年性白內(nèi)障等。《本草通玄》解釋了枸杞子治療眼病的機制：枸杞子補腎益精，水旺則骨強，而消渴、目昏、腰疼膝痛無不愈矣[13]。 枸杞子主要成分枸杞多糖，有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用，還能促進視網(wǎng)膜損傷的修復(fù)[14-15]。 丹參常用于血瘀性眼病或其他眼病兼有血瘀者，也用于頭昏失眠、視瞻昏渺者[16]，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)丹參中的隱丹參酮、木犀草素、丹參酮ⅡA等化學(xué)成分可調(diào)節(jié)RP 發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵靶點蛋白，從而抑制RP進程[17]。 枸杞子與丹參合用，共奏補虛活血之功[18]。

本研究采用RP 經(jīng)典動物模型RCS（rdy-/-， p-/-）大鼠為主要研究對象，以枸杞子加丹參灌胃治療。從檢測視網(wǎng)膜細胞凋亡指數(shù)為切入點，在抗細胞凋亡層面上，發(fā)現(xiàn)枸杞子加丹參能減輕RP 病變時有害因素導(dǎo)致的視網(wǎng)膜細胞凋亡的發(fā)生，保護視功能。

綜上所述，以枸杞子加丹參為代表藥的“補虛活血”法治療原發(fā)性RP 的分子生物學(xué)機制，可能與減輕RP 經(jīng)典動物模型RCS(rdy-/-， p-/-）大鼠視網(wǎng)膜感光及神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，從而起到保護視功能作用。