黃 河，王 晶，方 園，劉 密，2，常小榮*，馮 芳*

（1.湖南中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙410208；2.瀏陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 瀏陽410300；3.郴州市第一人民醫(yī)院西院，湖南 郴州423000）

冠心病是臨床高死亡率疾病之一，臨床多采用藥物、介入、外科手術(shù)等來改善冠狀動脈血供、降低心肌耗氧量，但各種血運重建手段在恢復心肌供血供氧時可同時導致心肌細胞損傷甚至壞死，即心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury， MIRI)，導師常小榮教授在課題組多年灸法研究的基礎(chǔ)上，提出艾灸的溫熱刺激具有溫通、溫補效應這一學術(shù)思想[1-2]，其中，“溫通”即“以溫促通”，“通”具有通暢、通達、通調(diào)等含義，艾灸溫通效應可以產(chǎn)生人體氣血運行通暢的效應，即借助灸火的熱力作用于機體特定腧穴或部位，通過疏通經(jīng)絡使氣血運行通暢，最終正氣得復而邪氣得去，與《靈樞·經(jīng)水》提出的“十二經(jīng)之多血少氣……與其皆少血氣……其治以針艾，各調(diào)其經(jīng)氣”一致，即艾灸的溫通效應具有通調(diào)機體各經(jīng)氣血的作用。

國外研究證實局部熱刺激可有效減少心肌缺血梗死面積[3-4]，國內(nèi)一項研究表明艾灸內(nèi)關(guān)穴預處理對MIRI 大鼠心肌細胞具有保護作用[5]，由于內(nèi)關(guān)穴主治心臟疾病及經(jīng)脈循行部位的其他疾病[6-7]，對治療心臟疾患具有特異性，且課題組前期研究也證實[8-11]：選用內(nèi)關(guān)穴電針可增加心肌組織內(nèi)源性保護物質(zhì)活性和含量，同時減少相關(guān)物質(zhì)的釋放以促進MIRI心肌組織形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)修復，最終對MIRI 大鼠心肌產(chǎn)生保護作用。而心肌細胞中B 細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、低氧誘導因子-1α(HIF-1α)及天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)在MIRI 中具有重要作用，故本研究以此展開，以MIRI 大鼠為實驗對象，探討艾灸內(nèi)關(guān)穴預處理對大鼠MIRI 的預保護作用是否與心肌細胞中Bcl-2、HIF-1α 及Caspase-3 的變化有關(guān)，為艾灸溫通理論對MIRI 的保護機制提供進一步實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

40 只SD 大鼠（SPF 級）由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，動物合格證號:SCXK(湘)2011-0003，體質(zhì)量250～350 g，雌雄各半。 所有大鼠適應性喂養(yǎng)7 d 后隨機分為4 組，每組10 只，即：正常組、模型組（MIRI 模型）、艾灸5 d 組（艾灸內(nèi)關(guān)5 d+MIRI 模型）、艾灸10 d 組（艾灸內(nèi)關(guān)10 d+MIRI模型）。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 TGL-18R 臺式冷凍離心機（珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司）；HH-S2 恒溫水浴箱（河南金博儀器制造有限公司）；QL-901 漩渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；164-5050 電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；E-201-C精密PH 計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；DY89-1 電動玻璃勻漿器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；PIKO REAL 96 熒光定量RCP 儀、SPL0960 熒光PCR 板（美國Thermo 公司）；DYCZ-24EN 電泳槽、DYCZ-40A 轉(zhuǎn)膜儀、DYCP-31DN 水平瓊脂糖電泳槽（北京六一儀器廠）。

1.2.2 主要試劑 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、麗春紅（美國Sigma 公 司）、HRP goat anti-mouse IgG（美國Proteintech 公司）、RIPA 裂解液（中國北京普利萊基因技術(shù)有限公司）、蛋白酶抑制劑（德國Merck公司）、蛋白磷酸酶抑制劑（瑞士Roche 公司）、SuperECL Plus 超敏發(fā)光液（美國Thermo pierce 公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（加拿大Fermentas 公司）。

1.3 模型制備

將SD 大鼠仰臥位固定于操作臺之上，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/100 g），去毛后碘伏常規(guī)消毒，打開胸腔，將心包膜輕輕剪破，小心提起左心耳，將0 號線穿于冠狀動脈左前降支1/3處，采用硅膠管結(jié)扎，以大鼠ST 段改變及冠脈向外膨脹發(fā)紺為成功結(jié)扎，結(jié)扎40 min 后剪開硅膠管，即恢復左前降支灌流60 min[5，12]。

1.4 穴位定位

內(nèi)關(guān)穴：前肢內(nèi)側(cè)腕關(guān)節(jié)上方約3 mm 左右尺橈骨縫間[13]。

1.5 艾灸方法

將大鼠仰臥位固定于鼠板之上，內(nèi)關(guān)穴處去毛，將2 支點燃后的艾條分別固定，將燃燒端對準大鼠雙側(cè)內(nèi)關(guān)穴皮膚上方約0.5 cm 處，及時彈去艾灰并調(diào)整施灸距離，將穴區(qū)溫度控制在42 ℃左右，每次20 min，每天1 次，艾灸5 d 組與艾灸10 d 組大鼠分別艾灸5 d 與10 d。正常組與模型組同時只捆綁束縛20 min，不艾灸，連續(xù)5 d。

實驗用艾條由南陽漢醫(yī)艾絨有限責任公司（豫衛(wèi)健用字〔2004〕第N0248 號）提供，規(guī)格為4 mm×120 mm×90 支。

1.6 檢測指標及方法

實驗第1 天對正常組進行腹主動脈采血，摘取大鼠心臟組織，經(jīng)處理后進行相應指標檢測；于實驗第5 天對模型組、艾灸5 d 組大鼠，實驗第10 天對艾灸10 d 組大鼠進行分別心肌缺血再灌注處理，然后進行腹主動脈采血，摘取大鼠心臟組織，經(jīng)處理后進行相應指標檢測。

1.7 Western blot 檢測心肌細胞中Bcl-2、HIF-1α、Caspase-3 的表達

1.7.1 樣品制備 剪取0.25 g 心肌組織，用冰預冷的PBS 沖洗后置于勻漿器中，加入300 μL RIPA裂解液后反復研磨，直至肉眼看不見組織塊；研磨后置于冰上蛋白裂解30 min；并于4 ℃低溫離心機中離心15 min（12 000 rpm），將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移至0.5 mL 的離心管中，凍存于-20 ℃冰箱。

1.7.2 蛋白濃度檢測 按照BCA 蛋白定量試劑盒（Wellbio，YX-W-C202）使用說明操作，測定三者蛋白濃度。

1.7.3 杭原抗體反應 經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)模、封閉、一抗孵育[用1×TBST 將一抗按照Caspase-3（1∶1 000）、Bcl-2（1∶500）、HIF-1α（1∶200）、β-actin（1∶4 000）比例稀釋，將膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜。孵育結(jié)束，1×TBST 洗3 次，每次15 min。]、二抗孵育（用1×TBST 稀釋HRP 標記的二抗，稀釋比例為1∶3 000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育45～60 min。 孵育結(jié)束，1×TBST 洗3 次，每次15 min。 ）后，行ECL 顯影沖洗曝光。

1.8 RT-PCR 檢測心肌細胞中Bcl-2、HIF-1α、Caspase-3 mRNA 的相對表達

1.8.1 實驗前準備 將1 mL DEPC 加入121 ℃，20 min 濕熱滅菌三蒸水中搖勻16 h， 制備0.1% DEPC水；將提取RNA 所需器械及耗材浸泡于1% DEPC水中過夜，第二天撈起用紙包裝好，121 ℃，60 min濕熱滅菌后，備用。

1.8.2 RNA 的瓊脂糖凝膠電泳 Trizol 提取心肌細胞總RNA 后，配制1%變性瓊脂糖凝膠，取2 μL RNA后按1∶5 的比例與loading buffer premix 混勻，于170 V 恒壓電泳，溴酚藍前沿遷移至凝膠總長2/3處停止電泳；凝膠成像。

1.8.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄 以組織總mRNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，20 μL 反應體系（0.2 mL 無酶PCR tube管）下，取1 μL RNA（約3 μg）、1 μL Random primer、10 μL 無菌無酶水理水，70 ℃加熱5 min，迅速插入冰中冷卻，再依次加入4 μL 5×Reaction buffer、2 μL dNTP、1 μL RNase inhibitor，37 ℃加熱5 min，再加入1 μL M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（200 units）、42 ℃，1 h；72 ℃反應10 min。 所得cDNA 于－20 ℃凍存。

1.8.4 qRT-PCR 引物序列 采用SYBR 法，在NCBI 上搜索目的基因序列，并用Primer 5 軟件設計（南京金斯瑞合成引物）。

1.9 統(tǒng)計學分析

本研究所得實驗數(shù)據(jù)以SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以“±s”表示，先進行正態(tài)性、方差齊性檢驗。 滿足正態(tài)性，則組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，方差齊時選擇LSD 法，方差不齊時選擇Dunnett T3 法；不滿足正態(tài)性則選擇秩和檢驗。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 艾灸預處理對MIRI 心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠心肌細胞中HIF-1α及Caspase-3 的蛋白表達顯著增高（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，艾灸5 d組和艾灸10 d 組大鼠心肌細胞中HIF-1α 及Caspase-3 的蛋白表達顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 蛋白表達顯著增高（P＜0.01）；與艾灸5 d 組相比，艾灸10天組大鼠心肌細胞中HIF-1 α 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），Bcl-2 蛋白表達顯著增高（P＜0.05），Caspase-3 的蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。 見表1。

表1 各組大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表達的比較（±s，n=10）

注：與正常組相比，★★P＜0.01；與模型組相比，▲▲P＜0.01；與艾灸5 d組相比，●P＜0.05，●●P＜0.01

組別正常組模型組艾灸5 d組艾灸10 d組HIF-1α 0.245±0.103 0.962±0.132★★0.687±0.103▲▲0.627±0.217▲▲Bcl-2 0.674±0.080 0.439±0.052★★0.634±0.075▲▲0.697±0.069▲▲●Caspase-3 0.288±0.071 0.428±0.086★★0.293±0.097▲▲0.280±0.053▲▲●●

2.2 艾灸預處理對MIRI 心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表達的影響

與正常組相比，模型組大鼠心肌細胞中HIF-1α及Caspase-3 的mRNA 表達顯著增高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，艾灸5 d 組和艾灸10 d 組大鼠心肌細胞中HIF-1α 及Caspase-3 的mRNA 表達顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表達顯著增高（P＜0.01）；與艾灸5 d 組相比，艾灸10 d 組大鼠心肌細胞中HIF-1α和Caspase-3 的mRNA 表達顯著降低（P＜0.01 或P＜0.05），Bcl-2 mRNA 表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的比較（±s，n=10）

表2 各組大鼠心肌細胞中HIF-1α、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達的比較（±s，n=10）

注：與正常組相比，★★P＜0.01；與模型組相比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與艾灸5 d 組相比，●P＜0.05，●●P＜0.01

組別正常組模型組艾灸5 d組艾灸10 d組HIF-1α 0.584±0.054 0.753±0.046★★0.653±0.057▲▲0.601±0.046▲▲●Bcl-2 3.968±1.588 0.986±0.412★★1.928±0.300▲▲1.824±0.632▲▲Caspase-3 0.973±0.118 1.673±0.540★★1.373±0.214▲1.179±0.656▲▲●●

3 討論

心肌細胞的大量凋亡是MIRI 過程中最主要的分子生物變化，而Bcl-2 家族蛋白在細胞凋亡過程中伴有重要角色，其機制主要通過抑制Caspase 蛋白酶等物質(zhì)活性而發(fā)揮抗細胞凋亡作用[14-15]，當心肌細胞受損或凋亡時其表達顯著下降[16]。HIF-1α 是細胞內(nèi)保持氧穩(wěn)態(tài)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，在細胞缺氧調(diào)節(jié)中起重要作用，低氧狀態(tài)下可誘導細胞增強HIF-lα 蛋白水平和HIF-1 DNA 結(jié)合活性，使得細胞HIF-lα 表達水平增加，激活細胞膜上的酸敏感離子通道，最終進一步破壞心肌細胞[17-18]。Caspase-3是細胞凋亡過程中重要的凋亡蛋白酶[6]，可導致細胞凋亡，其活化后作用于特異性底物，使得細胞發(fā)生相關(guān)生化及形態(tài)學改變致使細胞凋亡[19]。本研究中，艾灸組大鼠心肌細胞內(nèi)Bcl-2 的蛋白表達及mRNA含量均有所增高，同時HIF-1α 和Caspase-3 的蛋白表達及mRNA 含量與模型組相比均有所降低，提示艾灸預處理可以緩解大鼠MIRI 所引起的心肌缺氧狀態(tài)、心肌細胞損傷、增殖活性抑制或細胞凋亡，最終起到保護作用；與艾灸5 d 組相比，艾灸10 d 組大鼠心肌細胞中Bcl-2 的蛋白表達更高，HIF-1α 基因表達更低，Caspase-3 的蛋白和基因表達更低，提示艾灸10 d 在緩解MIRI 所引起的心肌細胞細胞凋亡方面稍優(yōu)于艾灸5 d，這充分體現(xiàn)了艾灸效應的程度性和差異性作用特點，提示下一階段研究增設多組不同艾灸時間組可能更好的證實這一點。

古代關(guān)于艾灸溫通作用的相關(guān)論述眾多，如《靈樞·刺節(jié)真邪》中“火氣已通，血脈乃行”是關(guān)于艾灸溫通效應最早的記載；《傷寒論》云：“少陰病，吐利，手足不逆冷……脈不至者，灸少陰七壯……少陰病脈不至”，提示可用灸法以溫通陽氣而復脈；元·羅天益《衛(wèi)生寶鑒·中風灸法》曰：“凡治風莫若續(xù)命湯……要收全功，必須火艾為良”，提出對于中風患者艾灸疏通血脈是治療的關(guān)鍵；清·吳亦鼎《神灸經(jīng)綸·說原》記載：“灸者，溫暖經(jīng)絡，宣通氣血……滯者得行”，提出灸法以溫促通是通過促進和保持機體氣血運行通暢。 現(xiàn)代研究也表明，不同溫熱刺激可以引起不同的生物學效應， 溫度低于50 ℃時血管擴張，血流加快，高于50 ℃時血管收縮，血流減慢[20]。 本研究采用的艾條溫和灸多為較低的溫熱刺激， 與課題組提出的以溫促通——“溫通” 不謀而合。MIRI 臨床可據(jù)其表現(xiàn)歸屬為“心痛”“胸痹”范疇[21-22]，其主要病機為心脈痹阻，病位在心，多因氣血不足，心脈失養(yǎng)，不榮則痛，或心脈氣滯、血瘀、寒凝等痹阻， 不通則痛。 內(nèi)關(guān)穴為手厥陰心包經(jīng)之絡穴，出屬心包絡，代心受邪，故臨床上用于治療心疾血證，主治心臟疾病及經(jīng)脈循行部位的其他疾病[18-19]。有研究指出：艾灸內(nèi)關(guān)穴預處理對MIRI 的保護作用無外乎取艾灸溫通效應中的溫陽行痹、通脈止痛之義[5]，從本研究結(jié)果看，艾灸溫通效應對MIRI所引起的心肌細胞損傷具有保護作用，進一步為艾灸溫通理論提供理論支撐，同時也為艾灸溫通理論提供了科學的詮釋。