李露芳 蘇國萬 張佳男 李 理 趙謀明

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 廣州510640）

醬油是中國傳統(tǒng)的液態(tài)調(diào)味品，至今已有兩千多年的歷史，目前在亞洲甚至是歐美國家都得到廣泛應(yīng)用[1-2]。醬油以植物蛋白、碳水化合物為主要原料，經(jīng)微生物酶作用發(fā)酵水解成多種氨基酸及糖類物質(zhì)，再進(jìn)一步發(fā)生復(fù)雜的生物化學(xué)變化，形成特殊色澤、香氣和滋味[3-5]。我國幅員遼闊，各地區(qū)人民飲食習(xí)慣也存在差異。不同醬油廠家在原料來源、發(fā)酵方式、生產(chǎn)工藝等方面的差異，使其風(fēng)味、香氣、口感乃至營養(yǎng)價(jià)值和整體質(zhì)量都大不相同[6]。醬油產(chǎn)品具有區(qū)域性強(qiáng)、集中度低的特點(diǎn)，導(dǎo)致我國醬油市場規(guī)模效益低、產(chǎn)品質(zhì)量水平不穩(wěn)定。糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品法典委員會（FAO/WHO Codex Commission）會員國對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及安全也有所重視[7-8]。

醬油的滋味在一定程度上體現(xiàn)其質(zhì)量水平，影響市場接受度，然而醬油滋味的國家標(biāo)準(zhǔn)或評價(jià)體系較少。其中，理化分析主要針對氨態(tài)氮含量檢測，即通過氨基酸態(tài)氮含量高低對醬油進(jìn)行分級，氨態(tài)氮含量愈高，醬油愈鮮，等級愈高[9]。而醬油的滋味是多種呈味組分間交互作用的結(jié)果，單純地檢驗(yàn)氨氮含量存在局限性。滋味評價(jià)主要基于感官分析，GB/T 18186-2000《釀造醬油》中規(guī)定醬油的滋味品質(zhì)應(yīng)味鮮美醇厚、咸甜適口[10]。由于感官分析依賴于評價(jià)員，具有主觀性強(qiáng)、穩(wěn)定性差、易疲勞、效率低等不足[11-12]，因此，有必要探究新型的分析手段以完善醬油的滋味評價(jià)體系。

電子舌是基于人體味覺器官結(jié)構(gòu)及機(jī)理，通過味覺傳感器采集電響應(yīng)信號，對樣品進(jìn)行識別、分析，它具有客觀性強(qiáng)、檢測閾低、工作效率高等優(yōu)點(diǎn)，便于實(shí)時(shí)檢測、快速分析[13-14]。電子舌技術(shù)作為新型分析手段，在飲料、肉制品的區(qū)分識別、質(zhì)量控制等方面均取得較大進(jìn)展[15-19]，而在醬油中應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道甚少，目前主要涉及滋味品質(zhì)評價(jià)、初步識別研究等[20-22]。本文以不同品牌的醬油樣品為研究對象，優(yōu)化電子舌測定的基本方法，同時(shí)結(jié)合多種模式識別方法，研究電子舌對不同品牌醬油的定量分析、滋味評價(jià)及區(qū)分能力。

1 材料與方法

1.1 原料

采用市售生抽醬油作為試驗(yàn)原料，均屬于高鹽稀態(tài)醬油，同型號醬油取樣2 個(gè)批次，不同批次間生產(chǎn)日期差異控制在3 個(gè)月內(nèi)。具體品牌見表1。

表1 醬油樣品基本信息及編號Table 1 Basic information and number of soy sauce samples

1.2 儀器

TS-5000Z 電子舌，日本Insent 公司；KND-2C型定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；916Ti-Touch氨氮儀，瑞士萬通中國有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，尤尼科（上海）儀器有限責(zé)任公司；A300 自動氨基酸分析儀，曼默博爾（德國）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 電子舌測定條件優(yōu)化

1）味感的篩選 醬油樣本用蒸餾水稀釋30倍進(jìn)行味感測定，包括鮮、咸、苦、酸、甜5 個(gè)基本味感以及澀感和鮮味回味、苦味回味、澀味回味。通過對輸出值的分析，簡化味感及相關(guān)傳感器的選擇，以便顯著表征醬油味感特點(diǎn)。

2）稀釋倍數(shù)的確定 醬油固形物濃度較高，采用電子舌直接測試不僅會對味覺傳感器材料造成不良影響，還會影響測試結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此，測試前醬油分別用蒸餾水稀釋10，20，30，40，50倍，再進(jìn)樣測試，確定最佳稀釋倍數(shù)。

3）回味參數(shù)的確定 鮮味回味是醬油滋味的重要表征指標(biāo)之一[23]，是鮮味醇厚感、持久性的體現(xiàn)。電子舌系統(tǒng)的回味測試程序傳感器進(jìn)行鮮味回味（飽滿感）測定前，需要進(jìn)行短暫的清洗，模擬口腔中吞咽食物后再次感知鮮味強(qiáng)度的動作，因此清洗的時(shí)間長短是體現(xiàn)飽滿感的重要影響因素。分別選擇3，6，9，12 s 作為測試前的清洗時(shí)間，參考感官評價(jià)的結(jié)果，選擇最佳清洗時(shí)間。

1.3.2 電子舌數(shù)據(jù)采集 本研究的味覺分析儀器采用日本insent 公司的TS-5000Z 電子舌，配有6個(gè)味覺傳感器，其中，AAE，CA0，CT0，C00，AE1，GL1 分別對鮮、酸、咸、苦、澀、甜敏感。數(shù)據(jù)采集前，電子舌系統(tǒng)已進(jìn)行自檢，以保證測試結(jié)果的可靠性及穩(wěn)定性，測試溫度控制在20 ℃左右。具體測試步驟如下：

1）傳感器于浸泡液中穩(wěn)定90 s 進(jìn)行初步清洗以除去膜表面雜質(zhì)，其中，鮮、咸、酸傳感器使用陰離子浸泡液，甜、苦、澀傳感器使用陽離子浸泡液；

2）各傳感器于參比液Ⅰ、參比液Ⅱ中分別清洗2 min；

3）各傳感器于參比液Ⅲ中穩(wěn)定30 s，測得電勢值Vr；

4）各傳感器于醬油樣本溶液中穩(wěn)定30 s，測得電勢值Vs；

5）鮮味、苦味、澀味傳感器于參比液Ⅳ、參比液Ⅴ中分別清洗3 s；

6）鮮味、苦味、澀味傳感器于參比液Ⅵ中穩(wěn)定30 s，測得電勢值Vr’；

電勢差V1=Vs-Vr，即為基本味感的輸出值；電勢差V2=Vr’-Vr，即為鮮味、苦味、澀味回味的輸出值。每個(gè)樣本進(jìn)行5 次平行測定，選擇后3 次數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.3.3 感官分析 感官評價(jià)采用定量描述分析（QDA）法[24]，以9 點(diǎn)數(shù)字標(biāo)度為評分標(biāo)尺，0～9 分的強(qiáng)度變化依次為無感覺、閾值感、微弱、中等、強(qiáng)烈[25]。感官試驗(yàn)于（23±2）℃的評價(jià)室進(jìn)行，由8 名具有感官分析經(jīng)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)員（男性3 名，女性5名，年齡22～28 歲）組成評價(jià)小組，對醬油的鮮味回味逐一打分，最后收集評價(jià)表進(jìn)行匯總分析。

1.3.4 基本成分測定方法 采用甲醛電位滴定法測定氨態(tài)氮含量[26]；采用沉淀滴定法測定食鹽含量[26]；采用甲醛值法測定總酸含量[26]；總糖含量的測定參考苯酚-硫酸法[27]并作適當(dāng)調(diào)整；游離氨基酸的測定參考Zheng等[28]的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析方法 電子舌電信號輸出值通過系統(tǒng)自帶的計(jì)算方式輸出味覺得分值，分值低于0 表示低于人的感官閾值。相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson 相關(guān)性分析。采用主成分分析（PCA）、判別因子分析（DFA）和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（ANN）對不同醬油樣本進(jìn)行模式識別，采用偏最小二乘法（PLS）建立基本理化成分與電子舌輸出值的定量模型。分析均由SPSS 19.0 軟件完成，繪圖由Origin 8.0 軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 測試條件的優(yōu)化

2.1.1 味感的篩選 電子舌輸出的各味感分值如表2所示。由表可知，不同樣本的鮮味和咸味較強(qiáng)，分別達(dá)到11.75 和6.33，苦味、甜味、飽滿感（即鮮味回味）在1～2 左右，而酸味、澀味、苦味回味、澀味回味均較弱，分值接近于0。

表2 不同醬油樣本的各滋味指標(biāo)均值Table 2 Mean scores of each taste index in different soy sauce samples

不同品牌醬油味感相對強(qiáng)度的箱形圖如圖1所示。由圖可見，不同醬油的樣本在酸味、鮮味上差異性較大，極差值分別達(dá)到了5.47 和4.66，為差異性最明顯的滋味指標(biāo)；苦味、飽滿感、咸味、甜味的極差值在1.12～2.45 之間；而澀味、苦味回味、澀味回味的極差值都在0.1 左右，可見在這3 個(gè)滋味指標(biāo)上，不同醬油樣本不僅數(shù)值上接近于0，且不同樣本之間差異極小。由此可見，在醬油中這些味感不具有代表性，且由于電響應(yīng)值很低，更容易產(chǎn)生誤差。

進(jìn)一步對刪除澀味、苦味回味、澀味回味前后的25 組不同醬油樣本的電子舌數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析，如圖2所示。由圖可見，刪除前后PCA 圖分布趨勢相似，樣本之間的區(qū)分度提高。分析主成分貢獻(xiàn)率發(fā)現(xiàn)，前2 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率從75.014%提高到84.467%。

為了簡化測試流程以及優(yōu)化數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，提高分析準(zhǔn)確率，可剔除一些不必要的冗余數(shù)據(jù)。因此，進(jìn)行醬油的滋味分析時(shí)，采用酸味、苦味、鮮味、鮮味回味（飽滿感）、咸味、甜味即可。

圖1 不同醬油樣本各滋味指標(biāo)相對強(qiáng)度箱形圖（n=25）Fig.1 The box plot of relaive intensity of each taste index in different soy sauce samples（n=25）

2.1.2 稀釋倍數(shù)的確定 對同一醬油分別稀釋10，20，30，40，50 倍進(jìn)行味感測定，結(jié)果如圖3所示。

圖2 刪除澀味、苦味回味、澀味回味前、后不同醬油樣本的PCA 圖Fig.2 PCA results of different soy sauce samples before and after deleting astringency，bitter aftertaste and astringency aftertaste

由圖3可見，隨著稀釋倍數(shù)的增加，酸味、苦味、鮮味、咸味以及飽滿感均不同程度的下降，但甜味變化呈現(xiàn)出不同趨勢。在10～30 倍的稀釋范圍內(nèi)，稀釋倍數(shù)愈大，甜味反而愈強(qiáng)；在30～50 倍的稀釋范圍內(nèi)，甜味隨著稀釋倍數(shù)的增大而減小，這可能與甜味傳感器的特殊性有關(guān)。糖等一般甜味物質(zhì)為電中性物質(zhì)，在電子舌類脂膜表面的吸附較難引起電位變化，而本研究中的電子舌傳感器采用了雙層膜結(jié)構(gòu)，外層用于表面吸附，內(nèi)層則由特殊通路傳導(dǎo)特征電位值的變化[29]，因此吸附程度會影響甜味的測試。醬油作為復(fù)雜的食品體系，具有豐富的呈味物質(zhì)，尤其是鮮味及咸味相應(yīng)的滋味組分。雖然電子舌相對感官而言具有更低的閾值和更大的測定范圍，然而在某些滋味組分濃度過高的情況下，會影響甜味物質(zhì)在甜味傳感器膜上的吸附程度，從而使得甜味測定值偏低，與實(shí)際情況不符。稀釋倍數(shù)為30 倍時(shí)，甜味強(qiáng)度最大，繼續(xù)增大稀釋倍數(shù)，甜味強(qiáng)度減小，此時(shí)甜味強(qiáng)度的變化遵循稀釋規(guī)律。由此可見，對于醬油樣品而言，在稀釋達(dá)到30 倍時(shí)，甜味物質(zhì)在膜上的吸附能力較為理想，同時(shí)，該稀釋濃度下對其它味感的表達(dá)沒有不良影響，不同味感之間的橫向比較在稀釋前后仍呈現(xiàn)一致規(guī)律。因此，在電子舌測定前將醬油稀釋30 倍，更能綜合反映醬油樣品的味感特性。

2.1.3 飽滿感參數(shù)的確定 傳感器進(jìn)行飽滿感（鮮味回味）測定前，需要進(jìn)行短暫的清洗，模擬口腔中吞咽食物后再次感知鮮味強(qiáng)度的動作。因此清洗的時(shí)間長短是體現(xiàn)飽滿感的重要影響因素。分別選擇3，6，9，12 s 作為回味測試前的清洗時(shí)間，具體數(shù)值如下。

圖3 不同稀釋倍數(shù)對醬油味感測定值的影響Fig.3 Effects of different dilution multiples on the tatse scores of soy sauce

圖4 不同清洗時(shí)間對醬油飽滿感測定值的影響Fig.4 Effects of different washing time on the scores richness of soy sauce

由圖可見，回味隨著清洗時(shí)間的增加而降低。在3 s 時(shí)，由于清洗時(shí)間較短，呈味物質(zhì)大部分還吸附在傳感器的分子膜上，因此對回味感知較強(qiáng)，分值達(dá)1.91；而在6 s 時(shí)，飽滿感分值在1.26 左右；在9～12 s 時(shí)，由于清洗時(shí)間略長，分子膜上殘余的呈味物質(zhì)基本上已經(jīng)洗脫，分值相對較低（0.4～0.75），體現(xiàn)的差異性較小，對鮮味回味的描述性較差。進(jìn)一步地，分別選擇3，6 s 為清洗時(shí)間，對不同醬油分別進(jìn)行電子舌測定及飽滿感的感官評價(jià)，將輸出結(jié)果進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，當(dāng)清洗時(shí)間為6 s 時(shí)，測試所得的回味輸出值與感官評價(jià)的結(jié)果具有更顯著的相關(guān)性（r=0.834），明顯高于3 s 的清洗時(shí)間（r=0.706）。原因可能是當(dāng)清洗時(shí)間為3 s 時(shí)，對不同樣本而言，大部分呈味物質(zhì)都吸附在分子膜上，因而飽滿感輸出值主要受鮮味強(qiáng)弱的影響。但研究表明，飽滿感是鮮味持久性、豐富性的表征，是諸多味感共同作用的結(jié)果，包括鮮味、咸味、甜味、苦味等。鮮味愈強(qiáng)，其飽滿感不一定愈強(qiáng)。當(dāng)清洗時(shí)間為6 s時(shí)，對持久性的表征與感官評價(jià)的相關(guān)性更強(qiáng)，更能表征回味的實(shí)際差異，因此選擇6 s 作為清洗時(shí)間。

2.2 電子舌對醬油理化指標(biāo)的定量預(yù)測

醬油滋味是多種呈味物質(zhì)共同作用的結(jié)果，呈味物質(zhì)種類、含量的差異會直接影響其滋味品質(zhì)，醬油中呈味物質(zhì)主要有鮮味氨基酸、總酸、苦味氨基酸、鹽分、總糖等，在不同程度上影響醬油的鮮味、酸味、苦味、咸味、甜味[30]。為了探究各傳感器對呈味物質(zhì)的響應(yīng)關(guān)系，利用化學(xué)分析方法測定不同醬油呈味物質(zhì)含量，將呈味組分與傳感器測定結(jié)果建立偏最小二乘法模型，以達(dá)到對滋味物質(zhì)進(jìn)行定量測定的目的，結(jié)果如表3。其中，自變量X1，X2，X3，X4，X5，X6分別為酸味、苦味、鮮味、飽滿感、咸味、甜味的電子舌輸出值。

表3 不同品牌醬油的電子舌測定值與理化指標(biāo)的PLS 回歸模型Table 3 PLS results between the content of taste substances and scores of taste sensors of soy sauce in different brands

由表可見，各方程顯著性P＜0.01，表明方程具有極顯著意義。由相關(guān)系數(shù)R2可見，對于7 個(gè)理化指標(biāo)而言，除了苦味氨基酸（0.781）外，R2都達(dá)到了0.8 以上。其中，pH、鹽含量的R2達(dá)到了0.9以上，原因可能是：對于pH 而言，H+濃度反映的是樣品中已解離的那部分酸的濃度，與口感酸度相關(guān)性較高；同時(shí)，醬油的咸味來源較單一，主要是NaCl，因此具有更強(qiáng)的相關(guān)性。而苦味氨基酸的相關(guān)系數(shù)相對較低，原因可能是：1）醬油中苦味本身較低，且不同醬油之間苦味的差異性也較小，在預(yù)測效果上相對較差；2）醬油中苦味不僅源于苦味氨基酸，可能還因?yàn)槭雏}中存在微量的氯化鎂、硫酸鈉等，不同廠家由于原料不同，苦味的來源也有所差異，相應(yīng)理化指標(biāo)具有不確定性。PLS 分析圖見圖5，總體而言，模型具有良好的預(yù)測性能，能通過對電子舌響應(yīng)值對理化指標(biāo)作出有效預(yù)測，且誤差在可接受范圍內(nèi)。

2.3 基于電子舌響應(yīng)值的模式識別分析

2.3.1 主成分分析 對不同品牌醬油的主成分分析見圖6。圖6a 為PCA 散點(diǎn)圖，圖6b 為因子載荷圖。

在PCA 分析中（圖6a），前2 個(gè)主成分貢獻(xiàn)達(dá)到83.79%。由圖6a可見，相同品牌的醬油樣本能夠聚成一類，雖然由于不同品牌的樣本數(shù)量、等級沒有保持一致，使得聚集情況有所差異，但8 個(gè)不同品牌醬油都得到了較好區(qū)分。醬油分類的主導(dǎo)因素是品牌而非等級，原因可能是不同廠家的醬油由于生產(chǎn)工藝、產(chǎn)地及原料等的差異，形成了不同滋味特點(diǎn)，而醬油等級是基于氨基酸態(tài)氮含量劃分的，不同品牌醬油即使等級相同，其它味感也有所差別。同一品牌不同等級的醬油雖然氨態(tài)氮含量不同，但在其它味感上體現(xiàn)了較大的相似性，因此在綜合分析時(shí)能夠聚集成類。其中，A，E，F(xiàn)，G等4 個(gè)品牌的醬油在PCA 分布上較為接近，說明其滋味特征有一定的相似之處。原因可能是它們都屬于廣東地區(qū)的醬油，因此在原料來源、飲食習(xí)慣等方面存在共同點(diǎn)。結(jié)合因子載荷圖（圖6b）可定性地認(rèn)為，廣東品牌的醬油具有更強(qiáng)的咸味及鮮味，其中，品牌F 的鮮味最強(qiáng)。此外，C 品牌醬油的鮮味較弱、酸味較強(qiáng)，滋味品質(zhì)相對較差；而D品牌醬油的甜味最強(qiáng)。

圖5 不同醬油理化指標(biāo)的PLS 分析圖Fig.5 PLS analysis of physicochenical index of different soy sauce

圖6 不同品牌醬油味覺傳感器的主成分分析圖Fig.6 PCA results of taste sensors of different brands of soy sauce

2.3.2 判別分析 不同品牌醬油的判別分析散點(diǎn)圖如圖7。

判別分析結(jié)果顯示，前2 個(gè)判別因子貢獻(xiàn)率分別為60.7%與37.4%，總解釋率達(dá)98.1%，結(jié)果與PCA 一致，電子舌能夠?qū)Σ煌放频尼u油進(jìn)行區(qū)分。同時(shí)，相比PCA 而言，DFA 具有更理想的區(qū)分效果，每個(gè)品牌的樣品能構(gòu)成一個(gè)獨(dú)立的族群、互相無重疊，不同品牌樣本間有明顯的組間差異。

建立Fisher 線性判別函數(shù)進(jìn)行回代判別及交叉驗(yàn)證，結(jié)果如表3所示。其中，在原始回代中，不同品牌的正判率均達(dá)到了100%；在交叉驗(yàn)證中，僅有品牌G 中的一個(gè)樣本被誤判為F 品牌，正判率為94.44%，其余品牌正判率均達(dá)到100%。判別函數(shù)對不同品牌醬油的正判率在99.33%，能達(dá)到理想的分類效果。

圖7 不同品牌醬油的DFA 散點(diǎn)圖Fig.7 DFA results of taste sensors of different soy sauce samples

表4 醬油不同品牌判別結(jié)果Table 4 Different brands’ classification results in soy sauce

2.3.3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析 將150 個(gè)樣本隨機(jī)分為訓(xùn)練集、預(yù)測集、保持集，運(yùn)用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析，以考察電子舌對不同醬油品牌的預(yù)測能力。輸入層神經(jīng)元為6 個(gè)，即6 個(gè)味感；輸出層神經(jīng)元為8 個(gè)，即醬油的品牌數(shù)；通過多次訓(xùn)練確定隱含層神經(jīng)元個(gè)數(shù)為5。訓(xùn)練集中止規(guī)則為錯(cuò)誤未減少，因此網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為：6-5-8。結(jié)果如表4所示，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能夠完全區(qū)分不同品牌醬油，樣品訓(xùn)練集、測試集和保持集的正確率均能達(dá)到100.0%。

表5 BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對不同品牌醬油的判別結(jié)果Table 5 The training and testing result of BPNN for different brands of soy sauce

3 結(jié)論

本文研究了電子舌在醬油中的區(qū)分識別。首先優(yōu)化了電子舌測試醬油的方法，研究表明，在稀釋倍數(shù)為30 倍時(shí)，電子舌對醬油整體滋味的檢測能達(dá)到較全面的效果，能夠更完善地體現(xiàn)其呈味特征；選擇苦味、酸味、鮮味、咸味、甜味、飽滿感作為電子舌測試的6 個(gè)指標(biāo)，能夠綜合地反映不同醬油的滋味特點(diǎn)，利于表征及識別，飽滿感清洗時(shí)間為6 s，與感官評價(jià)相關(guān)性更高。通過對不同醬油樣本的呈味組分與電子舌測定結(jié)果進(jìn)行偏最小二乘回歸分析，建立電子舌輸出值與理化指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果表明電子舌響應(yīng)信號能夠良好預(yù)測不同醬油的理化成分，除了苦味氨基酸（0.781）外，R2都達(dá)到0.8 以上。電子舌能對不同品牌的醬油進(jìn)行區(qū)分，采用PCA、DFA 均取得了良好的分類效果，前2 個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率分別達(dá)83.8%，98.1%，而BPNN 對樣品的預(yù)測能力更高，不同品牌醬油的訓(xùn)練集、測試集和保持集的正確率均能達(dá)到100.0%。