張 雯 王芳婷，2 倪 莉*

（1 福州大學食品科學技術研究所 福建省食品生物技術創(chuàng)新工程技術研究中心 福州350108 2 福建省新閩科生物科技開發(fā)有限公司 福州350108）

我國幅員遼闊，具有豐富的淡水和海水資源，漁業(yè)在我國具有重要的地位。據(jù)統(tǒng)計，2018年，海洋捕撈和養(yǎng)殖產值分別為2 228 億元和3 572 億元，淡水捕撈和養(yǎng)殖產值分別為465 和5 884 億元[1]。水產品營養(yǎng)豐富，在流通環(huán)節(jié)容易在內源酶和微生物的作用下發(fā)生腐敗。水產保鮮是確保水產品品質的關鍵環(huán)節(jié)，也是水產行業(yè)發(fā)展亟待解決和改進的關鍵環(huán)節(jié)。目前，水產品保鮮技術主要有物理保鮮、化學保鮮和生物保鮮3種形式[2]。動、植物來源的保鮮劑受原料限制，價格較高，微生物源保鮮劑成為篩選和應用的熱點[3]。微生物保鮮劑包括2 方面：利用微生物本身的成膜性、拮抗作用抑制腐敗菌的生長；利用微生物的次生代謝物抑菌[4]，如蠟樣芽胞桿菌、乳桿菌及一些曲霉，有報道用微生態(tài)及其代謝活性物質抑菌[5]。一些枯草芽孢桿菌菌株被批準作為益生菌施用在養(yǎng)殖行業(yè)[6]。病原菌入侵魚體的主要途徑是魚鰓、體表和腸道，它通過對黏液的粘附作用定植于宿主表面，從而大量滋生、分解魚體營養(yǎng)物質，導致魚體腐敗變質。而益生菌作為一種環(huán)境友好型的抗生素替代品，主要通過生成抑菌物質，調節(jié)機體免疫應答，競爭粘附位點，競爭營養(yǎng)物質等方式起到抑制病原菌、保護宿主的目的[7-9]。本文探討益生菌是否通過抑制腐敗菌對魚體各部位黏液的粘附作用，進而減少魚體攜帶腐敗菌的初濃度，抑制腐敗菌的滋生，從而延緩魚體腐敗進程。

本課題組前期篩選得到一株具有顯著抑制希瓦氏菌、假單胞菌活性的枯草芽孢桿菌[10-11]，通過體外試驗證明了腐敗菌的腐敗能力與粘附能力具有正相關性[12]。本文在此基礎上，通過在飼料中添加枯草芽孢桿菌，喂養(yǎng)羅非魚，研究枯草芽孢桿菌是否改變腐敗菌對羅非魚腸道的定植和滋生，并最終影響冰鮮魚的鮮度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 希瓦氏菌屬（Shewanella）MA1-5，MA1-7 和MA1-13，假單胞菌屬（Pseudomonas）R3-1，R3-2 和R3-5，枯草芽孢桿菌BS08：由福州大學食品科學技術研究所保藏。

1.1.2 試驗材料 130 尾羅非魚幼魚，平均體重20～30 g。

1.1.3 試劑與設備

1）主要試劑 ATP 關聯(lián)物標準品（純度>98%），上海藍季科技發(fā)展有限公司、上海麥克林生化科技有限公司，其它常規(guī)試劑均為分析純。糞便基因組提取試劑盒（TIANamp Stool DNA Kit），北京天根生化科技有限公司。

2）主要儀器 SW-CJ-IFD 型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；GNP-9080 型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；CF16RXⅡ冷凍高速離心機，日本日立公司；L-2000 高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 飼料的制備 取一環(huán)枯草芽孢桿菌BS08接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min，培養(yǎng)24 h 后，將種子液以5%的比例接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)48 h，獲得發(fā)酵菌液。用離心機進行離心，去除培養(yǎng)液，加入生理鹽水制成菌懸液。

菌懸液以15%（質量分數(shù)）加入阿拉伯膠保護劑，通過噴干燥制成菌粉，以便保藏?？莶菅挎邨U菌噴霧干燥工藝的參考最佳參數(shù)：進料速度550 mL/h，入口溫度150 ℃，出口溫度84 ℃，霧化壓力0.1 MPa，最終活菌保鮮劑菌含量在5×1010個/g。

將一定含量的菌粉溶于無菌水中，均勻噴灑到普通飼料上，在44 ℃烘箱里干燥24 h，封裝于密閉容器中4 ℃下保存，最終添加量為10 g（菌量）/kg（飼料），以不添加枯草芽孢桿菌的飼料為對照組。

1.2.2 羅非魚的喂養(yǎng) 130 尾20～30 g 羅非幼魚根據(jù)以下4 組飼喂方式養(yǎng)殖。每組約30～35 尾羅非魚幼魚，平均分配飼養(yǎng)在2 個約75 L 的箱子中。每箱水溫控制在（28±1）℃，每日換二分之一水。按每日1%的體重比例飼喂飼料，正常飼料飼喂7 d 作為適應期，之后根據(jù)以下處理組分組喂養(yǎng)7 d。

對照組（CK）：正常水體中，普通飼料喂養(yǎng)組。每日按體重的1%飼喂飼料。

枯草芽孢桿菌組（BS）：正常水體中，益生菌飼料喂養(yǎng)組。每日按體重的1%飼喂枯草芽孢桿菌飼料。

腐敗組（SP）：腐敗水體中，添加普通飼料喂養(yǎng)組。腐敗水體中，添加108個/mL 希瓦氏菌和假單胞菌各5 mL，每日按體重的1%飼喂飼料。

腐敗改善組（BS+SP）：腐敗水體中，添加益生菌飼料喂養(yǎng)組。腐敗水體中，添加108個/mL 希瓦氏菌和假單胞菌各5 mL，每日按體重的1%飼喂枯草芽孢桿菌飼料。

1.2.3 樣品提取 試驗結束后，將全部的魚進行碎冰急凍，并按組分裝，置于4 ℃環(huán)境，每日換冰，冰鮮保藏，0～2 d 取樣。將羅非魚洗凈，去鱗、去魚鰭，用無菌水沖洗數(shù)次。在無菌環(huán)境下將魚體解剖，取全段魚腸樣品。將魚體和腸道樣品保存在-20 ℃冰箱中用于鮮度測定和腸道微生態(tài)檢測。

1.2.4 高通量測序 使用糞便基因組DNA 提取試劑盒（QIAamp Stool Mini Kit）提取魚 腸道DNA。以16SV3-V5 為目標區(qū)域進行高通量測序。

本研究選取對照組（CK）、枯草芽孢桿菌組（SB）、腐敗菌組（SP）、改善組（SP+SB）4 組在冰鮮保藏第1 天與第2 天的魚腸道樣品，各取2 份平行，共計16 個樣品進行糞便基因組的提取，樣品信息表見表1，進行Illumina Miseq 雙端測序（Pair-end sequencing）。

表1 樣品信息表Table 1 Sample information table

1.2.5 TVB-N 測定 參考中華人民共和國食品安全國家標準[13]（GB 5009.228-2016）測定揮發(fā)性鹽基氮。

1.2.6 K 值測定 參考中華人民共和國水產行業(yè)標準[14]（SC/T3048-2014）測定K 值。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 結果采用SPSS 22.0 的Duncan檢驗對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 腸道菌群的多樣性變化分析

圖1 為不同處理組的分類單元（OTU）韋恩圖，由圖1可知：1）初始階段，枯草芽孢桿菌和腐敗菌單獨添加均使OTU 數(shù)量增加，而枯草芽孢桿菌和腐敗菌共同作用卻顯著減少了OUT 數(shù)量。2）腐敗的過程細菌總量增加，OUT 數(shù)量減少，說明菌株出現(xiàn)了優(yōu)勢富集。從富集程度來看，枯草芽孢桿菌和腐敗菌的共同作用對菌體多樣性影響最小，富集程度最低，貯藏初期檢測到的OUT 減少了57%，而其余3 組富集程度均大于64%。

Shannon 指數(shù)以及Simpson 指數(shù)同時反映群落中物種豐富度和均勻度，ACE 和Chao1 指數(shù)體現(xiàn)群落的豐富度。如表2所示，對照組（RS1，RS2）的腸道菌群OUT 數(shù)量下降，Chao1 指數(shù)下降，Shannon 指數(shù)上升，多樣性的指標綜合反映了腸道菌群的物種豐富度隨著時間的推移明顯下降，均勻度上升，說明在貯藏過程中出現(xiàn)了菌群優(yōu)勢化趨勢，少數(shù)菌的豐度上升；枯草芽孢桿菌組（RS3，RS4）的腸道菌群OUT 數(shù)量下降，Chao1 指數(shù)下降，Shannon 指數(shù)基本不變，說明飼喂枯草芽孢桿菌的羅非魚在儲藏過程中腸道菌群豐富度稍下降，但均勻度變化小。同時，枯草芽孢桿菌組羅非魚樣品腸道初始菌群均勻度就處于較高的水平；腐敗菌組（RS5，RS6）的腸道菌群OUT 數(shù)量下降，Chao1 指數(shù)顯著下降，Shannon 指數(shù)顯著下降，第2天與第1 天相比腸道菌群豐富度和均勻度顯著下降，說明腐敗菌組的菌群在儲藏后出現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢化趨勢；改善組（RS7，RS8）腸道菌群的變化和枯草芽孢桿菌組類似，OUT 數(shù)量稍有下降，Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)變化不顯著。由此可見，枯草芽孢桿菌的加入能夠調節(jié)魚腸道菌群處于一個較為均衡穩(wěn)定的狀態(tài)。

圖1 不同樣品OTU 韋恩圖Fig.1 Venn profile of OTU in different samples

表2 腸道菌群多樣性指數(shù)比較Table 2 Comparison of intestinal flora diversity index

2.2 多元統(tǒng)計方法的腸道菌群群落結構的比較分析

將4 組飼養(yǎng)條件下的羅非魚腸道菌群進行主坐標分析（Principal coordinates analysis，PCoA）。根據(jù)圖2 中散點的分布情況可以看出，菌群總體變化的趨勢是二象限至一象限至四象限。冰鮮1 d 后的樣品分布較為聚集，各組間羅非魚腸道菌群群落結構差異較小。隨著冰鮮時間至第2 天后，腸道中細菌的滋生導致腸道菌群的群落結構出現(xiàn)較大差異。經過腐敗菌處理的腐敗菌組和改善組處于第四象限，而枯草芽孢桿菌組處于第一象限，說明飼喂含枯草芽孢桿菌的飼料對羅非魚的腸道菌群的變化具有阻遏作用，對照組的樣品在第2天后分別處于第一和第四象限，說明未額外添加枯草芽孢桿菌的樣品菌群個體變化差異或隨機性較強，添加枯草芽孢桿菌減少了這些個體變化的差異，維持了菌群結構的穩(wěn)定性。

圖2 4 組飼養(yǎng)條件下羅非魚腸道菌群的主坐標分析（PCoA）Fig.2 Principal coordinate analysis（PCoA）of intestinal flora of tilapia in four feeding conditions

2.3 微生物群落結構變化

進一步分析不同處理組的羅非魚腸道在貯藏過程中發(fā)生的菌群結構變化，尤其是希瓦氏菌、假單胞菌以及枯草芽孢桿菌的群落變化規(guī)律。

對菌群分布的熱圖與豐度分析（圖3）發(fā)現(xiàn)厚壁菌門（Firmicutes），擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）是羅非魚腸道門水平上含量最高的3種優(yōu)勢菌。從屬水平看，對照組中，氣單胞菌屬（Aeromonas）、擬桿菌屬（Bacteroides）和希瓦氏菌屬（Shewanella）冰鮮貯藏過程中顯著生長，其中希瓦氏菌屬是常見水產品優(yōu)勢腐敗菌，氣單胞菌是水產養(yǎng)殖中常見的病原菌之一，通常引發(fā)魚類細菌性腸炎、敗血癥、癤瘡病等，嚴重可造成死亡[15-16]。腐敗菌組中，假單胞菌（Pseudomonas）在冰鮮貯藏期間明顯增加，而鄰單胞菌（Plesiomonas）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus）和 丙 酸 桿 菌 屬（Propionibacterium）等多種魚腸道中原生健康菌群的相對含量顯著降低。正常情況下，健康魚類腸道菌群和腸黏膜免疫系統(tǒng)處于一種動態(tài)平衡，通過合成營養(yǎng)素、拮抗?jié)撛谥虏【染S護宿主的健康生長，腐敗菌的加入對羅非魚的正常腸道菌群造成了一定破壞。不動桿菌屬（Acinetobacter）的顯著增加也提高了羅非魚染病的概率，Xia等[17]鑒定鮑氏不動桿菌為斑點叉尾鯰的病原體。假單胞菌和希瓦氏加入水體中對羅非魚腸道菌群造成了較大的改變，這可能對魚的生長性能造成不利影響。含枯草芽孢桿菌BS08 飼料的喂養(yǎng)能夠恢復腸道菌群的結構與組成，且愛德華氏菌（Edwardsiella）這類致病菌的減少表明枯草芽孢桿菌BS08 對魚類感染性疾病具有潛在的保護作用[18]。

圖3 不同樣品菌群屬間熱圖與前10 名菌的豐度Fig.3 Heatmap of different samples and the abundance of the top 10 bacteria at the genus level

進一步分析對比希瓦氏菌、假單胞菌和枯草芽孢桿菌在各處理組中相對含量的變化（圖4）：冰鮮第1 天，希瓦氏菌相對含量從大到小依次為：SP>SP+SB>CK>SB，說明天然水體中和外源添加的希瓦氏菌均可在腸道很好地粘附，但枯草芽孢桿菌可在一定程度上抑制希瓦氏菌的粘附程度。無論是天然水體還是外源添加的假單胞菌的粘附性都顯著低于希瓦氏菌。同時，枯草芽孢桿菌在魚腸道的定植程度也顯著低于希瓦氏菌。

希瓦氏菌在天然水體養(yǎng)殖的羅非魚冰鮮貯藏期逐漸成為優(yōu)勢菌，但在外源微生物干擾的作用下，在很大程度上被抑制。冰鮮第1 天到第2 天，空白對照組（RS1，2）希瓦氏菌相對含量迅速上升，假單胞菌的比例輕微下降，幾乎無枯草芽孢桿菌；枯草芽孢桿菌組（RS3，4）希瓦氏菌顯著下降，假單胞菌和枯草芽孢桿菌的比例顯著上升；腐敗組（RS5，6）希瓦氏菌顯著降低，假單胞菌的比例顯著上升，枯草芽孢桿菌比例輕微上升；改善組（RS7，8）希瓦氏菌顯著降低，假單胞菌的比例輕微上升，枯草芽孢桿菌顯著上升。說明，若不添加枯草芽孢桿菌，希瓦氏菌將在腸道中成為優(yōu)勢菌；前期希瓦氏菌在腸道中的定植數(shù)量明顯高于假單胞菌，在第2 天，腸道中的希瓦氏菌數(shù)量顯著下降，假單胞菌數(shù)量上升，說明假單胞菌能夠對希瓦氏菌產生競爭性抑制作用。Gram等[19]發(fā)現(xiàn)在魚體組織中，當假單胞菌數(shù)量達到108～109CFU/g 時，會抑制希瓦氏菌的生長，課題組前期研究工作也同樣發(fā)現(xiàn)，假單胞菌對希瓦氏菌的生長具有拮抗作用[20]。

圖4 不同樣品中希瓦氏菌、假單胞菌和枯草芽孢桿菌的相對含量Fig.4 Relative abundance of Shewanella，Pseudomonas and Bacillus subtilis in different samples

2.4 添加枯草芽孢桿菌對冰鮮魚鮮度變化的影響

新鮮魚類由于其高蛋白和高水分含量，在貯藏期間容易滋生微生物，使魚體腐敗變質。在魚體品質變化的初期階段，體內糖原經糖酵解反應被分解成乳酸，pH 下降，激活三磷酸腺苷酶，導致三磷酸腺苷（ATP）在內源酶的作用下降解，主要反應途徑為：ATP→ADP→AMP→IMP→HXR→HX[21]。因此，通過檢測ATP 降解產物的變化可以判斷出魚的新鮮程度。此外，在微生物代謝分泌的水解酶作用下，蛋白質水解產物和游離氨基酸增加，同時產生氮、三甲胺、硫化物、醇類等揮發(fā)性物質，產生不愉快的腐臭味[22-23]。因此，揮發(fā)性物質是測定魚類新鮮度的重要參數(shù)。本文以揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）和K 值作為鮮度變化的指標，探討枯草芽孢桿菌對延緩羅非魚腐敗變質的作用。

羅非魚在冷藏過程中揮發(fā)性鹽基氮TVB-N值變化如圖5所示。4 組魚肉樣品TVB-N 值隨著冷藏時間均出現(xiàn)不同程度的增長。4 ℃冷藏24 h后，不同處理組之間產TVB-N 的能力具有顯著性差異（P<0.05）。發(fā)生腐敗的程度從高到低依次為SP>CK>SP+SB>SB。加入腐敗菌的水體最容易讓魚腐?。ǜ瘮〗M，SP），通過飼喂枯草芽孢桿菌飼料，魚抗腐敗的能力顯著提高，無論是在腐敗水體中的魚（改善組，SB+SP）或是正常水體的魚（對照組，CK），其腐敗程度都比未添加枯草芽孢桿菌飼料時（對照組CK 和腐敗組SP）顯著減緩。4 ℃冷藏48 h 后，腐敗組SP 接近腐敗的終點（30 mg/100 g），腐敗程度從高到低依然為SP>CK>SP+SB>SB。經過枯草芽孢桿菌飼料喂養(yǎng)的魚腐敗過程顯著緩慢，其腐敗程度與冷藏24 h 時的正常水體組魚沒有顯著差異。

一般認為，魚體的K 值在20%以下為一級鮮度，20%～40%為二級鮮度。40%～60%為三級鮮度，高于60%則腐敗。由圖6可知，K 值總體上隨著貯藏時間的增加呈上升趨勢。24 h 時，4種處理方式的魚鮮度沒有顯著差異；48 h 后，4 組處理方式的魚鮮度出現(xiàn)顯著差異，正常水體和腐敗水體中的魚鮮度顯著變差；添加枯草芽孢桿菌飼料喂養(yǎng)的魚在貯藏48 h 后，雖然鮮度比24 h 有顯著損失，但比未經過枯草芽孢桿菌飼養(yǎng)的魚鮮度損失有顯著的緩解（P<0.05）；改善組的K 值上升最為緩慢，說明枯草芽孢桿菌在魚腸道的成功定植，對腐敗菌起到了拮抗作用，在一定程度上能夠延緩羅非魚冰鮮期的腐敗變質。

圖5 4 個處理組的魚肉在冰鮮過程中TVB-N 值變化（mg/100 g）Fig.5 Changes of TVB-N value（mg/100 g）of fish from four treatment groups during ice storage

圖6 4 組處理魚肉樣品冷藏過程中K 值變化Fig.6 Changes of K value of fish from four treatment groups during ice storage

3 結論

本課題將枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑加入魚飼料中，通過分組喂養(yǎng)來確定枯草芽孢桿菌對羅非魚腸道菌群的影響。高通量測序結果表明，枯草芽孢桿菌作為益生菌劑喂養(yǎng)能夠對羅非魚腸道菌群起到顯著調節(jié)作用。與不添加枯草芽孢桿菌的對照組和腐敗菌組相比，枯草芽孢桿菌組的羅非魚腸道菌群多樣性維持在一個相對穩(wěn)定的水平?？莶菅挎邨U菌對羅非魚的腸道菌群的變化具有阻遏作用，延緩冰鮮魚腸道優(yōu)勢菌群的富集現(xiàn)象。希瓦氏菌在腸道內定植程度大于假單胞菌，試驗篩選得到的枯草芽孢桿菌可定植在魚腸道內，并且可抑制希瓦氏菌在魚腸道內定植，阻止希瓦氏菌將在腸道中的優(yōu)勢富集。同時，腐敗菌的加入對羅非魚的正常腸道菌群造成了一定程度的破壞，含枯草芽孢桿菌BS08 飼料的喂養(yǎng)能夠恢復腸道菌群的結構與組成，并減少某些機會致病菌，表明枯草芽孢桿菌BS08 對魚類感染性疾病具有潛在的保護作用。

在冰鮮冷藏過程中，通過TVB-N 和K 值為指標判斷魚的鮮度表明，枯草芽孢桿菌的添加顯著延緩了冰鮮魚的腐敗程度。

綜上所述，本文利用枯草芽孢桿菌對細菌的拮抗特性來研究其在水產養(yǎng)殖和保鮮中的應用。結果說明了枯草芽孢桿菌有望成為改善羅非魚腸道菌群，并延緩腐敗菌定植和滋生的雙效益生菌添加劑，為開發(fā)新型的微生態(tài)保鮮劑提供新思路。