王紹帆 黃 歡 何 君 韓育梅

（內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特010018）

將馬鈴薯抗性淀粉添加于發(fā)酵乳中，一方面可以在非淀粉源的食品中發(fā)揮抗性淀粉在人體腸道內的益生作用；另一方面可以發(fā)揮糖類大分子的作用，對發(fā)酵乳的品質產生影響?，F階段有關馬鈴薯抗性淀粉在發(fā)酵乳中的研究還不夠深入。本文選用RS2型玉米抗性淀粉（G）和微波-濕熱法制備的RS3型馬鈴薯抗性淀粉（W），研究它們在發(fā)酵乳加工、貯藏過程中含量和形態(tài)的變化，探討抗性淀粉在發(fā)酵乳中的作用機理，為深入研究糖類大分子與蛋白質分子的相互作用以及實際生產應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微波-濕熱法制備的馬鈴薯抗性淀粉（純度≥90%），實驗室自制；RS2型玉米抗性淀粉（高直鏈玉米淀粉，純度≥90%），國民淀粉；全脂乳粉，恒天然公司；YF-L812 型發(fā)酵乳發(fā)酵劑和Bb-12 雙歧桿菌，科漢森；葡萄糖檢測試劑盒，貝博生物；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

MCR-3E 常壓微波合成萃取儀，鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司；SX-500 蒸汽滅菌器，TOMY公司；Rheolaser Master 型光學法微流變分析儀、TLAB AGS 型Turbiscan 穩(wěn)定性分析儀，Formulaction 公司；Phenom Pro 掃描電子顯微鏡，Phenom-Word 公司；BK3200 型光學顯微鏡，重慶光電儀器有限公司；T6 新世紀型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司。

1.3 試驗條件

1.3.1 樣品的制備 按照國標GB 19302-2010[3]，根據工藝“牛奶→標準化→加入添加劑→均質→加熱殺菌→冷卻→加入發(fā)酵劑與益生菌→恒溫發(fā)酵→攪拌冷卻→后熟→保藏”制備發(fā)酵乳。添加劑分別為1.5%的高直鏈玉米淀粉（G）和微波-濕熱法制備的馬鈴薯抗性淀粉（W）。發(fā)酵劑選用丹麥科漢森YF-L812 型號發(fā)酵劑（含德氏乳桿菌保加利亞亞種與嗜熱鏈球菌），益生菌為丹麥科漢森雙歧桿菌BB-12。發(fā)酵結束后，將其在4 ℃冰箱中保存。

1.3.2 抗性淀粉含量的變化 參考Coni[4]的方法作適當修改，乳液與抗性淀粉混勻加熱、均質、95℃處理5 min、發(fā)酵2 h、發(fā)酵結束以及貯藏期1，3，7，14，21 d，取上述各階段的抗性淀粉添加量為質量分數1.5%的發(fā)酵乳樣品，折算樣品中抗性淀粉的含量。

1.3.3 抗性淀粉結構的變化 參考孫慢慢[5]的方法，制備含有質量分數1.5%抗性淀粉的發(fā)酵乳，選取乳液與抗性淀粉混勻加熱后、均質后、95 ℃處理5 min 后、發(fā)酵2 h 后、發(fā)酵結束后以及貯藏期1，7，14，21 d 為取樣測定時間點，在光學顯微鏡400 倍下觀察，并采集圖像。

1.3.4 抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠形成微觀結構的影響 參考Cui等[6]與Bakirci等[7]的方法，將貯藏1 d 含有質量分數1.5%抗性淀粉的發(fā)酵乳樣品在10 kV 電壓和5 000 倍掃描電子顯微鏡下觀察，并采集圖像。

1.3.5 抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠形成過程的微流變分析 參考Titapiccolo等[8]的方法，利用光學微流變儀監(jiān)測含有質量分數1.5%抗性淀粉的發(fā)酵乳發(fā)酵期與貯藏1 d 凝膠體系的穩(wěn)定性。

1.3.6 抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠體系的穩(wěn)定性分析參考白潔等[9]和呂長鑫等[10]的研究，使用穩(wěn)定性分析儀，采用850 nm 近紅外光源的監(jiān)測探頭檢測發(fā)酵乳發(fā)酵期與貯藏1 d 凝膠體系的穩(wěn)定性。

然而，CBA常規(guī)賽打響后，與上個賽季相比關鍵球員減員嚴重、備戰(zhàn)明顯不足的西王男籃，因實力下降和傷病拖累，尤其是遭遇了雙外援同時傷缺的罕見意外，連續(xù)5輪被迫全華班作戰(zhàn)，結果5戰(zhàn)皆北，臨時拼湊起新的雙外援組合后短時間內亦難有起色，從賽季初穩(wěn)居八強迅速下滑到中游偏下位置，打進季后賽目標岌岌可危。此前就對小外援是否需要更換發(fā)生過激烈爭論的球迷和媒體反應更加強烈，西王俱樂部乃至西王集團承受著巨大的輿論壓力。

1.4 數據分析與處理

穩(wěn)定性數據采用Turbiscan 型穩(wěn)定分析儀自帶的Turbiscan Easysoft 軟件進行數據分析；微流變數據采用Rheolaser Master 型光學法微流變分析儀自帶的Smart 軟件進行數據分析。利用Orgin 9.4 繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵乳加工、貯藏過程中抗性淀粉殘留量的變化

含抗性淀粉發(fā)酵乳的功能性一方面反映了發(fā)酵乳自身的益生作用，另一方面體現在乳中所含抗性淀粉的功能性。因此研究抗性淀粉在發(fā)酵乳加工、貯藏過程中含量的變化，不僅有助于綜合評價其功能性，而且可進一步研究抗性淀粉在發(fā)酵乳中的存在形式和作用方式。

圖1 抗性淀粉的殘留量Fig.1 Residual quantity of resistant starches

由圖1可見，這2種抗性淀粉在發(fā)酵乳加工、貯藏過程中的含量整體呈現下降趨勢，且下降的程度不同。在P=0.05 的顯著水平下，Ducan 檢驗發(fā)現，G 與W 的殘留量差異明顯，其中G 殘留量維持在50%左右，W 的殘留量較高且穩(wěn)定在60%以上。此外，發(fā)酵乳加工、貯藏過程中不同的階段對抗性淀粉的殘留量有顯著差異（P＜0.05），在P=0.05 的顯著水平下，經Ducan 檢驗發(fā)現，發(fā)酵乳在前3 個階段抗性淀粉殘留量變化不顯著，說明物理加工過程以及發(fā)酵前期對于抗性淀粉影響不大。在發(fā)酵期結束后，抗性淀粉的含量有明顯降低，可能是發(fā)酵后期乳酸菌大量產酸且體系中積累了大量的酸[11]，進而影響了抗性淀粉的含量。在發(fā)酵乳加工、貯藏全過程中，抗性淀粉約有40%的損失，且多集中于貯藏期。由此可得，添加W是最好的選擇。

2.2 發(fā)酵乳加工、貯藏過程中抗性淀粉形態(tài)的變化

如圖2所示，混勻后發(fā)酵乳中淀粉顆粒形態(tài)完整，均質對其形態(tài)無明顯改變，可能是由于淀粉顆粒有一定的剛性結構且粒徑較小，經高溫殺菌處理后W 顆粒邊緣輪廓變得模糊，其處于一種相對膨脹的狀態(tài)；而G 無明顯變化，可能是由于G顆粒較小導致其膨脹松散的形態(tài)不易被觀察到。發(fā)酵開始后，由于蛋白質凝膠網狀結構的形成，淀粉的背景結構呈現出不均一的云霧狀，且隨著貯藏時間變長顏色也逐步加深，可推測抗性淀粉顆粒一定程度上分散在發(fā)酵乳的凝膠網狀結構里。貯藏期2種樣品中均能發(fā)現較為完整的淀粉顆粒，這與抗性淀粉的殘留量所反映結果一致，驗證在含有抗性淀粉的發(fā)酵乳加工貯藏全過程中有一定量且結構完整的抗性淀粉存在。

圖2 抗性淀粉的顆粒形態(tài)Fig.2 Granular shape of resistant starch

2.3 抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠形成微觀結構的影響

由圖3可見，與空白組相比，含抗性淀粉的發(fā)酵乳微觀結構明顯不同，含W 的發(fā)酵乳微觀結構幾乎沒有空洞，并且酪蛋白膠粒更加致密，而含G的發(fā)酵乳微觀結構疏松，且酪蛋白膠粒之間有大量空隙。含W 的發(fā)酵乳凝膠結構更為完整且較為均勻，其電鏡圖片的左上角處還發(fā)現有不同于蛋白質凝膠網狀結構的規(guī)則塊狀物，同樣在含G 發(fā)酵乳電鏡圖片的右下角也出現了表面光滑的橢球狀物，推測分別是W 與G 的淀粉顆粒。而W 的淀粉顆粒不同于G，鑲嵌在發(fā)酵乳的凝膠網狀結構中，邊緣與酪蛋白存在一定的融合與接觸。就微觀結構而言，W 更有助于發(fā)酵乳形成完整均一的微觀結構。

圖3 發(fā)酵乳微觀結構掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrograph of the fermented milk microstructure

2.4 抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠形成過程微流變學參數的影響

發(fā)酵乳的加工過程包括發(fā)酵和后熟，凝膠結構形成于發(fā)酵階段，而在后熟期其凝膠結構也會受到溫度和后酸化的影響。如圖4、圖5、圖6所示，所有樣品的EI，MVI 和SLB 變化趨勢大體相同。EI 在0～2.5 h 的發(fā)酵時間內基本保持水平，此時酪蛋白還沒有形成網狀的凝膠結構，同時MVI和SLB 處于較大程度的波動狀態(tài)。含有G 發(fā)酵乳的MVI 較高，而含有W 發(fā)酵乳的MVI 較低，可能是由于隨著乳液中微生物的產酸，原來水包油型結構被破壞，原有的蛋白膠體開始解離，且菌體生長繁殖也導致乳液中微粒大小變化[12]。W 對應的SLB 最大且大于空白組偏向于液體性質，G 使發(fā)酵乳相對于空白組在0～2.5 h 發(fā)酵時間內更接近于固體性質。發(fā)酵時間在2.5 h 左右，所有樣品的EI，MVI 以及SLB 均出現拐點，此時凝膠形成也稱為凝膠點，且各樣品達到凝膠點的時間較為接近，說明與空白對照相比抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠的速率影響不大。凝膠點后，主要是酪蛋白完成解離并開始聚集形成凝膠結構，所有樣品的EI 和MVI快速上升至峰值。此時發(fā)酵乳中EI 大小的順序是W>K>G，而各個樣品的MVI 較為接近。這與所有樣品的SLB 出現谷值表現一致，因為凝膠結構使樣品更多地顯現固體性質，也說明體系中膠體微粒移動受到酪蛋白聚集的影響[13]。然后所有樣品的EI 開始緩慢降低并趨于平緩，同時SLB 逐漸上升后趨于平緩，而MVI 則出現一個谷值后上升，可能由于微生物繼續(xù)產酸而導致一部分在酪蛋白膠束內部和之間的膠體磷酸鈣溶解，使得凝膠結構弱化[14]。隨著pH 不斷接近酪蛋白的等電點，酪蛋白顆粒間靜電排斥減少且疏水性的相互作用增強，更多蛋白簇相互鏈接進而形成最終的凝膠結構[14]。發(fā)酵結束時，含有抗性淀粉發(fā)酵乳的SLB 在0.5 附近且低于空白組的SLB 值，EI 與MVI 均大于空白組，且含W 發(fā)酵乳的EI 與MVI 大于含G的發(fā)酵乳，因此含有抗性淀粉的發(fā)酵乳具有相對堅固固體結構的特性，相比G，W 能夠強化凝膠結構。后熟期結束后空白組的SLB 仍高于其它樣品組，因此含抗性淀粉的發(fā)酵乳相比空白組更趨向固體性質。空白組的EI 最低，其次為含G 的發(fā)酵乳，W 在后熟階段EI 有一定升高，說明其凝膠網狀結構變得更為緊密，與掃描電鏡觀察發(fā)酵乳的微觀結構表現一致，可能與W 顆粒影響網狀結構的收縮有關。各樣品的MVI 后熟過程中出現不同程度的下降，空白組的MVI 最低，其次為含G 的發(fā)酵乳，W 使發(fā)酵乳有較高的MVI。

圖4 發(fā)酵乳的EIFig.4 Elastic index of fermented milk during the fermentation

圖5 發(fā)酵乳的MVIFig.5 Viscosity index of fermented milk during the fermentation

圖6 發(fā)酵乳的SLBFig.6 Solid Liquid Balance of fermented milk during the fermentation

微觀分析發(fā)酵乳從發(fā)酵到后熟的過程發(fā)現，W 相對于G 和空白組使發(fā)酵乳有著更堅固的結構，同時也增加了黏度。因此，添加W 的發(fā)酵乳使得酪蛋白凝膠網狀結構結合得比較緊密，從而限制了大分子微粒的自由移動，同時出現較低的SLB 也可驗證其有更好的固體結構性質[12]。此外，2種抗性淀粉在發(fā)酵乳凝膠形成的過程中對凝膠的積極影響作用也存在差異性，W 更加有助于酪蛋白顆粒結合形成更加堅固的結構。

2.5 抗性淀粉對發(fā)酵乳凝膠體系穩(wěn)定性的影響

圖7 反應各發(fā)酵乳樣品在發(fā)酵及后熟期對應樣品高度的背散射光強相對于發(fā)酵起始階段的變化情況。背光參比值變大代表樣品所在高度的環(huán)境中微粒吸收光強值變大，表明顆粒變大，反之則代表吸收光強值變小而顆粒變??；參比值變化越大說明體系越不穩(wěn)定，圖像中正峰與負峰分別表示微粒出現較大程度的聚集或者分離，類似沉淀或澄清[15]。

圖7（空白）中樣品的背光散射圖反映了空白組發(fā)酵乳加工過程中穩(wěn)定性的變化。通過背光散射比值與時間的變化關系發(fā)現，所有樣品均出現不同程度的頂部澄清現象，這可能與酸化和冷凍導致凝膠網狀結構收縮引起持水力下降有關[16]。含有W 的發(fā)酵乳樣品中間部位散射光比值變化程度較大，說明相對于空白樣而言，含有W 的發(fā)酵乳形成的凝膠網絡結構中蛋白質類的大分子物質結構的變化更大，驗證了抗性淀粉使發(fā)酵乳凝膠網狀結構更為緊密，同時在一定程度上也會對蛋白質的粒徑產生影響[17]。含有G 的發(fā)酵乳中，中間段的光強變化較為均勻且平行變化的程度大于空白組，說明含G 酸乳中酪蛋白膠粒聚集程度較大，而在發(fā)酵乳的頂端，出現了較大幅度的澄清和聚集現象，乳清析出與脂肪上浮的情況較嚴重。圖8 反映的是各個樣品穩(wěn)定性動力學指數，表示樣品穩(wěn)定性隨時間的變化，其數值越大表明穩(wěn)定性越差[10]。因此，含W 發(fā)酵乳的微觀穩(wěn)定性優(yōu)于含G的發(fā)酵乳。

圖7 不同發(fā)酵乳樣品的背散射光光強值Fig.7 Back scattering light intensity values of different fermented milk samplese

3 結論

本試驗研究表明，在發(fā)酵乳加工貯藏過程中，W 相對于G 殘留量較高且維持在60%左右；2種抗性淀粉均保留著淀粉顆粒形態(tài)，但有不同程度的損耗，主要集中在發(fā)酵后期與貯藏期；W 更有助于發(fā)酵乳形成完整均一的微觀結構；含有W 的發(fā)酵乳微觀彈性較強且有助于酪蛋白顆粒結合形成更加堅固的結構；含W 發(fā)酵乳的微觀穩(wěn)定性優(yōu)于含G 的發(fā)酵乳。與空白對照相比，在發(fā)酵乳中添加W可提升發(fā)酵乳的品質以及潛在的益生功能性。

馬鈴薯抗性淀粉對發(fā)酵乳的影響效果存在由其理化性質導致的差異，推測作用方式為：作為填充物，增加凝膠網狀結構中蛋白質粒子的密度，增強發(fā)酵乳的黏度和穩(wěn)定性；在發(fā)酵期凝膠形成過程中，影響酪蛋白分子的解離與聚集，增加凝膠強度與結構穩(wěn)定性；影響乳酸菌的代謝，自身含量也受到乳酸菌代謝的影響，還可以保護發(fā)酵乳中的益生菌，同時結合自身含量可提升發(fā)酵乳的益生功能性。對于抗性淀粉在發(fā)酵乳加工貯藏過程中損失機理的研究，還可結合微生物代謝途徑以及抗性淀粉在對應環(huán)境中的穩(wěn)定性變化進行深入探討，從而有助于相關產品的市場推廣和公眾保健意識宣傳。

圖8 不同發(fā)酵乳樣品的穩(wěn)定性動力學參數Fig.8 Stability kinetic index of different fermented milk samples