韓菲菲 楊莎莎 趙 霞 丁夢(mèng)露 韓劍眾

（浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州310018）

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel diseases，IBDs）是一種反復(fù)發(fā)作的腸道慢性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn’s disease，CD）2 大類。目前，對(duì)IBDs 的具體病因尚不明確，免疫、營養(yǎng)以及環(huán)境等因素共同作用導(dǎo)致IBDs 發(fā)生或病程延長[1]。大量研究已證實(shí)機(jī)體自身免疫的驅(qū)動(dòng)因素對(duì)IBDs 發(fā)病有重要影響[2]?？股睾鸵嫔啬軌蚋纳艻BDs 臨床癥狀[3]。IBDs 典型病理特征之一是腸黏膜屏障功能受損[4]。維持腸黏膜屏障的完整性對(duì)腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定極其重要。

抗菌肽是宿主黏膜表面防御的一類重要分子，其中防御素和cathelicidins是哺乳動(dòng)物抗菌肽的2 大家族[5]。早期抗菌肽被定義為可殺滅致病性微生物。越來越多的新證據(jù)表明，這些肽在宿主防御方面發(fā)揮重要的作用。Cathelicidines 家族抗菌肽擁有復(fù)雜的受體介導(dǎo)功能，參與細(xì)胞增殖和遷移、免疫調(diào)節(jié)、傷口愈合以及血管新生等生理過程，被認(rèn)為是維持腸道屏障功能和免疫平衡的重要物質(zhì)[6]。LL-37（又稱hCAP-18）是目前人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的唯一的cathelicidins 家族抗菌肽。有研究證實(shí)LL-37 與IBDs 發(fā)病原因密切聯(lián)系；其在IBDs 患者體內(nèi)正?；蜓装Y性腸段黏膜中的調(diào)節(jié)表達(dá)是有區(qū)別的；UC 患者炎癥性腸組織中LL-37 的表達(dá)較CD 患者明顯升高[7]。雖有研究發(fā)現(xiàn)丁酸鹽、維生素D等通過調(diào)節(jié)cathelicidin 家族抗菌肽基因表達(dá)或分泌緩解IBD 癥狀[3]，然而cathelicidin 家族抗菌肽LL-37 對(duì)炎癥性腸病的影響機(jī)制尚不明確，LL-37是否能通過對(duì)腸道屏障施加保護(hù)緩解炎癥性腸病的癥狀需進(jìn)一步研究。本研究在建立急性潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的基礎(chǔ)上，探討LL-37 在維持和重建腸黏膜屏障完整性方面的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

體重18～22 g 雄性清潔級(jí)C57BL/6 小鼠40只，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供并飼養(yǎng)；動(dòng)物房溫度（20±2）℃，濕度50%，每日光照12 h，由杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供標(biāo)準(zhǔn)日糧。硫酸葡聚糖鈉（DSS，分子質(zhì)量36 000～50 000 u），購于MP 公司；LL-37（氨基酸序列LLGDFFRKSK EKIGKEFKRI VQRIKDFLRNLVPRTES），委托吉爾生化（上海）有限公司合成，純度>95%；ELISA檢測(cè)試劑盒，購于聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。免疫組化抗體，購自博士德生物工程有限公司。Primer Express 2.0 軟件設(shè)計(jì)小 鼠claudin-1（F：5′-AGTAACTTTGCCATAAGACCA-3′；R：5′-AAAGTGCAAAGACCGTC-3′），occludin（F：5′-ACTGGGTCAGGGAATATCCA - 3 ′；R ：5 ′ -TCAGCAGCAGCCATGTACTC -3′），ZO-1（F：5′-TCATCCCAAATAAGAACAGAGC -3′；R：5′ -GAAGAACAACCCTTTCATAAGC-3′），GAPDH（F：5' -GGTGAAGGTCGGTGTGAACG -3′；R：5′ -CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′）基因引物并委托上海生物工程有限公司合成。熒光定量PCR 所用試劑購自Roch 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將40 只小鼠隨機(jī)分為4組：C 組（正常飲水）、DSS 組（飲用3%DSS 水）、DL組（飲用3%DSS 水）和LL 組（正常飲水），小鼠自由采食和飲水，試驗(yàn)期共8 d；試驗(yàn)結(jié)束后，眼眶后靜脈叢取血，靜置離心取血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?；處死小鼠后，取新鮮結(jié)腸段用于跨上皮電阻測(cè)定；部分結(jié)腸組織固定于4%多聚甲醛溶液中用于后續(xù)石蠟包埋及組織切片；剩余結(jié)腸組織液氮凍存用于后續(xù)熒光定量PCR 檢測(cè)。

1.2.2 疾病活動(dòng)指數(shù)（Disease activity index，DAI）每日觀測(cè)小鼠體增重、糞便性狀、糞便隱血情況并評(píng)分[8]，根據(jù)上述3 項(xiàng)評(píng)分計(jì)算小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)。

1.2.3 結(jié)腸組織切片及HE 染色 參考文獻(xiàn)[9]方法，取多聚甲醛溶液中固定好的結(jié)腸腸段進(jìn)行脫水→透蠟→包埋→切片→貼片→染色→透明→封藏等過程制作組織切片并進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)。

1.2.4 免疫組化法分析結(jié)腸組織免疫細(xì)胞炎性浸潤 將結(jié)腸石蠟切片進(jìn)行脫蠟、梯度酒精復(fù)水、抗原修復(fù)封閉、一抗（CD177 兔抗鼠單克隆抗體、CD68 兔抗鼠單克隆抗體兔抗鼠單克隆抗體）和二抗（羊抗兔IgG-HRP）孵育、DAPI 顯核、甘油封片等過程后，在光鏡下觀察結(jié)腸組織炎性細(xì)胞浸潤情況，利用Image pro-plus 6.0 軟件分析；選取相同的棕黃色作為判斷所有陽性染色的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)每張照片進(jìn)行分析得出陽性細(xì)胞的累積光密度值（IOD）；每組所有照片的平均值代表該組的IOD值（Mean±SEM 表示）。

1.2.5 ELISA 檢測(cè)血清炎性細(xì)胞因子及腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP2）質(zhì)量濃度 取血并離心獲得各組小鼠血清，按試劑盒說明書測(cè)定血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 以及I-FABP2 含量。

1.2.6 尤斯室法檢測(cè)小鼠結(jié)腸通透性 將新鮮結(jié)腸組織固定于蠟板上，剝離粘膜組織并固定于尤斯室灌流系統(tǒng)的樣品室，兩側(cè)室各注入3 mL 氧合Kerbs 緩沖液，溫度維持在37 ℃。調(diào)節(jié)電壓鉗零電壓，以1 mV 刺激電壓每隔60 s 刺激0.5 s，按說明書步驟操作并記錄跨上皮電阻（Trans-epithelial electrical resistance，TEER）。

1.2.7 Real time PCR 檢測(cè)緊密連接蛋白表達(dá)水平 Trizol 法提取結(jié)腸組織總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（cDNA）合成試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，以GAPDH 為內(nèi)參基因，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)基因表達(dá)水平差異；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 操作步驟按SYBRRPremix Ex TaqTM說明書進(jìn)行；反應(yīng)流程為95 ℃預(yù)變性30 s，進(jìn)入循環(huán)流程：95℃變性10 s，60 ℃退火34 s，反應(yīng)40 個(gè)循環(huán)?；虻南鄬?duì)表達(dá)水平以2-△△Ct進(jìn)行分析，其中△Ct =目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct；△△Ct =試驗(yàn)組△Ct-對(duì)照組△Ct。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以Mean±SEM 表示；組間比較采用單因素方差分析。* 代表P<0.05，為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 LL-37 對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）的影響

試驗(yàn)期內(nèi)C 組和LL 組小鼠的體重、糞便性狀、糞便隱血情況評(píng)分接近正常水平，DAI 介于0～1 之間（圖1）；DSS 組小鼠的各項(xiàng)評(píng)分隨時(shí)間延長逐漸升高，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)DAI 超過2，而DL 組小鼠各項(xiàng)評(píng)分較DSS 組小鼠相比均顯著降低，至試驗(yàn)第7 天，各項(xiàng)評(píng)分均接近C 組，表明腹腔注射LL-37 明顯緩解了DSS 導(dǎo)致的小鼠體重降低、腹瀉以及腸道出血等癥狀，有效降低了小鼠DAI。

2.2 LL-37 對(duì)小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)的影響

光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織切片（圖2），C 組和LL 組小鼠結(jié)腸組織層次結(jié)構(gòu)清楚，形態(tài)正常，黏膜層完整。腺體排列整齊、緊密；隱窩形態(tài)正常，黏膜層可見大量杯狀細(xì)胞；高倍鏡下可見腸上皮細(xì)胞形態(tài)正常，固有膜內(nèi)以淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞為主。DSS 組小鼠結(jié)腸組織損傷主要以黏膜層和黏膜下層為主；病變部位組織腫脹，層次欠清，黏膜層腺體廣泛破壞，腸上皮細(xì)胞排列紊亂，杯狀細(xì)胞幾乎不可見，黏膜層缺損較重。而DL 組小鼠的結(jié)腸黏膜較完整，隱窩結(jié)構(gòu)基本正常，腸上皮細(xì)胞排列已明顯恢復(fù)。

圖2 小鼠結(jié)腸組織形態(tài)（×200，HE 染色）Fig.2 Histomorphological structure of the colon tissue（×200，H&E-stained sections）

2.3 LL-37 對(duì)小鼠結(jié)腸組織通透性的影響

ELISA 法檢測(cè)小鼠血液中腸型脂肪酸結(jié)合蛋白（I-FABP2）質(zhì)量濃度結(jié)果（圖3）揭示DSS 組小鼠血液中I-FABP2 質(zhì)量濃度顯著高于C 組小鼠（P<0.05），提示該組小鼠結(jié)腸機(jī)械屏障受到破壞；與DSS 組相比，DL 組小鼠血液中I-FABP2 質(zhì)量濃度有所降低（P<0.05），表明LL-37 在維持小鼠結(jié)腸正常通透性中發(fā)揮重要作用。

圖3 LL-37 對(duì)小鼠血清腸型脂肪酸結(jié)合蛋白的影響（＊P<0.05）Fig.3 Effect of LL-37 on I-FABP2 level in mice serum（*P<0.05）

圖4 LL-37 對(duì)小鼠結(jié)腸跨膜電阻的影響Fig.4 Effect of LL-37 on colonic transepithelial electrical resistance of mouse

利用尤斯室法對(duì)各組小鼠新鮮結(jié)腸通透性分析結(jié)果（圖4）表明，與C 組相比，LL 組小鼠結(jié)腸的跨上皮電阻變化不大，揭示正常小鼠腹腔注射LL-37 對(duì)其結(jié)腸組織的通透性影響較??；而DSS組小鼠結(jié)腸組織在剖取新鮮組織后0～60 min 內(nèi)的跨上皮電阻均顯著降低，表明結(jié)腸組織通透性增大是DSS 誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的主要癥狀之一；與DSS 組相比，DL 組小鼠結(jié)腸的跨上皮電阻則明顯回升，表明腹腔注射LL-37 明顯緩解了DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織通透性增加的癥狀。

2.4 LL-37 對(duì)小鼠結(jié)腸免疫細(xì)胞炎性浸潤程度的影響

免疫組化法特異性標(biāo)記結(jié)腸組織嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的結(jié)果表明，DSS 組小鼠結(jié)腸組織中的噬中性粒細(xì)胞（CD177+）和巨噬細(xì)胞（CD68+）數(shù)量與C 組相比均顯著增加（P<0.05），表明DSS組小鼠結(jié)腸黏膜存在明顯的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞炎性浸潤現(xiàn)象；與DSS 組相比，DL 組小鼠結(jié)腸中的噬中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量則發(fā)生了顯著降低（P<0.05），表明腹腔注射LL-37 能夠顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸組織免疫細(xì)胞的炎性浸潤，這可能與LL-37 明顯緩解小鼠腸道炎癥、潰瘍等癥狀密切相關(guān)。

圖5 LL-37 對(duì)結(jié)腸嗜中性粒細(xì)胞炎性浸潤的影響（×400，CD177+細(xì)胞）Fig.5 Effects of LL-37 on the infiltration of neutrophilic granulocyte（×400，CD177+ cells）

圖6 LL-37 對(duì)結(jié)腸巨噬細(xì)胞炎性浸潤的影響（×400，CD68+細(xì)胞）Fig.6 Effects of LL-37 on the infiltration of macrophagocyte（×400，CD68+cells）

2.5 LL-37 對(duì)小鼠結(jié)腸組織細(xì)胞因子分泌水平的影響

ELIAS 試驗(yàn)檢測(cè)各組小鼠血清中IL-1β，IL-6，TNF-α 分泌水平（圖7）的結(jié)果表明，與C 組相比，腹腔注射LL-37 對(duì)小鼠血清IL-1β，IL-6，TNF-α 分泌水平未產(chǎn)生顯著影響（P>0.05），而DSS 組小鼠血清中IL-1β，IL-6，TNF-α 分泌量均顯著增加（P<0.05）；與DSS 組相比，DL 組小鼠血清 中IL-1β，IL-6，TNF-α分泌水平均顯著降低（P<0.05）。

圖7 LL-37 對(duì)結(jié)腸細(xì)胞因子分泌水平的影響Fig.7 Effect of LL-37 on the secretion level of inflammatory cytokines

2.6 LL-37 對(duì)小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白基因表達(dá)水平的影響

熒光定量PCR 法比較各組小鼠結(jié)腸緊密連接蛋白mRNA 表達(dá)情況（圖8 的）結(jié)果表明，與對(duì)照組小鼠相比，DSS 組小鼠3種緊密連接蛋白mRNA 水平均顯著降低（P<0.05），而其中水閘蛋白-1 和閉鎖小帶蛋白-1 mRNA 在DL 組的表達(dá)水平與DSS 組相比均顯著增加（P<0.05）。

圖8 LL-37 對(duì)水閘蛋白-1、閉鎖蛋白和閉鎖小帶蛋白-1 3種緊密連接蛋白mRNA 表達(dá)水平的影響Fig.8 Effect of LL-37 on the mRNA expression level of claudin-1，occludin and ZO-1

3 討論

腸黏膜屏障在預(yù)防有害微生物和毒素侵入機(jī)體方面發(fā)揮重要作用。腸上皮組織損傷導(dǎo)致的腸黏膜屏障破壞以及隨之而來的炎癥反應(yīng)都是潰瘍性結(jié)腸炎的顯著特點(diǎn)。因此，抵御入侵的病原體和修復(fù)腸道屏障是重建腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)必不可少的要素。抗菌肽在上皮組織屏障保護(hù)方面的作用已被前期大量研究所證實(shí)。研究揭示，與LL-37 屬同源的小鼠cathelicidin 基因被敲除后，腸腔內(nèi)的人工移植菌群發(fā)生顯著改變，揭示了其在維持腸道環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用[10]。目前在人類胎糞及新生兒糞便中都檢測(cè)到了LL-37 的存在，也有研究證實(shí)了其與皮膚上皮組織和血管再生有密切關(guān)系[11]，但缺少LL-37 修復(fù)腸黏膜屏障功能方面的證據(jù)。本研究以DSS 誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠為模型，評(píng)價(jià)了LL-37 在保護(hù)腸黏膜屏障方面的功能。

正常腸黏膜屏障由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障與生物屏障4 部分共同構(gòu)成，任何一個(gè)環(huán)節(jié)的缺損都會(huì)影響腸黏膜屏障功能[12]。TEER是體外評(píng)價(jià)腸道機(jī)械屏障的常用指標(biāo)，能直接反映腸黏膜屏障的完整性[13]。此外，I-FABP 作為腸道上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白之一，正常情況下在血液中含量極微；當(dāng)腸黏膜受損、屏障功能發(fā)生障礙時(shí)，I-FABP 會(huì)透過腸道屏障入血。本研究結(jié)合TEER 和I-FABP2 質(zhì)量濃度證明了LL-37 在緩解DSS 對(duì)結(jié)腸組織通透性的破壞，保護(hù)腸道機(jī)械屏障功能方面的作用。

腸道機(jī)械屏障能有效阻止細(xì)菌穿透黏膜進(jìn)入深部組織，是腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。上皮細(xì)胞間的緊密連接由多種功能各異的蛋白質(zhì)組成。UC 發(fā)病時(shí)腸黏膜屏障通透性增加以腸上皮細(xì)胞旁路的通透性明顯增高為特征；而腸上皮細(xì)胞旁路的通透性主要受緊密連接（Tight junction，TJ）限制[14]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)40 多種腸黏膜上皮細(xì)胞TJ 的相關(guān)蛋白質(zhì)，主要有閉鎖蛋白（occludin）、水閘蛋白（claudin）、閉鎖小帶蛋白（Zonula occludens，ZOs）；TJ 蛋白在腸黏膜上皮細(xì)胞的表達(dá)下降，表明腸黏膜屏障通透性增高，腸黏膜屏障功能受損。本研究顯示DSS組小鼠腸上皮組織受損，同時(shí)水閘蛋白-1、閉鎖蛋白、閉鎖小帶蛋白-1 基因表達(dá)量顯著降低，說明腸上皮屏障功能嚴(yán)重破壞，是UC 典型的表現(xiàn)。在DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎的同時(shí)給予腹腔注射LL-37 則能夠減少因DSS 破壞導(dǎo)致的幾種緊密連接蛋白基因表達(dá)水平降低，從而有效緩解結(jié)腸機(jī)械屏障功能受到破壞。

腸黏膜的防御作用被認(rèn)為是執(zhí)行局部特異性免疫功能的主要場所[15]。腸黏膜屏障功能缺陷時(shí)，微生物抗原可以進(jìn)入腸黏膜固有層，從而誘導(dǎo)效應(yīng)T 細(xì)胞活化，啟動(dòng)黏膜免疫反應(yīng)；CD4+T 細(xì)胞作為腸黏膜炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，其分泌的白細(xì)胞介素-17（IL-17）具有強(qiáng)大的募集和激活嗜中性粒細(xì)胞的能力，能誘導(dǎo)活化T 細(xì)胞產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)IL-1β，IL-6，TNF-α等而誘發(fā)加重炎癥反應(yīng)[16]。本研究結(jié)果表明DSS 組小鼠結(jié)腸黏膜屏障受到破壞后，IL-1β，IL-6，TNF-α 濃度顯著增加，而同時(shí)腹腔注射LL-37 則明顯緩解了這些炎性細(xì)胞因子濃度的升高，從而減輕腸黏膜的炎癥反應(yīng)。炎性細(xì)胞浸潤被認(rèn)為是引起腸黏膜破壞的重要原因[17]。在免疫組化分析中，DSS 組小鼠結(jié)腸嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，這與結(jié)腸組織切片的結(jié)果相一致；給予LL-37 能夠使結(jié)腸免疫細(xì)胞的炎性浸潤程度大大減輕。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果揭示LL-37 能夠通過調(diào)節(jié)腸道通透性、跨上皮電阻、緊密連接蛋白表達(dá)等方式來緩解DSS 對(duì)小鼠結(jié)腸機(jī)械屏障的破壞，通過抑制促炎細(xì)胞因子的分泌來緩解結(jié)腸的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腸黏膜屏障的保護(hù)作用。