王 靖 張婧婕 韓 迪 閆文杰 朱 宏 韓 娟 梁克紅 仇 菊

（1 農業(yè)農村部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所 北京100081 2 北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心 北京100083）

白血病是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病以兒童和青年居多[1]。異基因造血干細胞移植（Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo -HSCT）是一種廣泛應用于白血病患者的治療方法，治愈率高。然而，患者移植后將會面臨駕馭和管理宿主免疫狀態(tài)極端變化的挑戰(zhàn)。移植前需進行大劑量放、化療和抗體介導的骨髓細胞清除過程，從而為移植進體內的造血干細胞提供空間。然而，隨之而來的嚴重免疫缺陷、免疫重建延遲和并發(fā)癥的發(fā)生，常常伴有生命危險，是移植相關疾病發(fā)生率和死亡率增加的重要因素[2-3]。移植后，供體免疫系統(tǒng)可以攻擊受體或“宿主”，即移植物抗宿主?。℅raft versus host disease，GVHD），是異基因造血干細胞移植的主要且常見的并發(fā)癥，癥狀包括發(fā)熱、肝脾腫大、腹瀉、感染等，嚴重者可導致死亡[4]。如何促進免疫重建（預防感染等并發(fā)癥和防止癌癥復發(fā)），同時避免GVHD等并發(fā)癥，是臨床上亟需解決的課題。

1 器官免疫互作與腸-肝-脾軸（ILS Axis）

allo-HSCT 后的免疫重建和GVHD 的發(fā)生、發(fā)展都與免疫系統(tǒng)密切相關。目前研究顯示，除了脾臟、胸腺、骨髓等免疫器官外，小腸、肝臟等組織作為非專職免疫器官，同樣參與機體免疫調節(jié)。其中肝臟、腸道和脾臟之間存在緊密的免疫互作。

在胚胎學方面，肝臟在發(fā)育過程中直接從前腸出芽；出生后早期脾臟中發(fā)現的部分B 細胞來自胎肝。在解剖學和生理學方面，下腸系膜靜脈主要收集大腸血液后注入脾靜脈，然后和主要收集小腸血液的上腸系膜靜脈匯合形成肝門靜脈，進入肝臟；循環(huán)系統(tǒng)中的血液通過肝動脈進入肝臟；而肝總管與膽囊管匯合成膽總管，開口于十二指腸[5-6]。此外，肝臟、腸道、脾臟之間可通過體循環(huán)進行相互作用。

生物學功能方面，三者之間同樣關系密切。首先，腸道微生物與宿主在腸道中以共生的方式存在，在消化中起重要作用，并且是黏膜免疫系統(tǒng)的一部分。正常情況下，除了小腸吸收的營養(yǎng)物質外，腸道中大量細菌的抗原和微生物產物可進入血液，隨門靜脈進入肝臟，調節(jié)肝臟免疫耐受。疾病狀態(tài)下，微生物組成的變化或腸道通透性的改變會促進微生物易位到門脈循環(huán)中，導致微生物細胞壁成分（來自革蘭氏陰性細菌的內毒素和來自真菌的β-葡聚糖）和DNA等產物通過血液輸送到肝臟，被肝細胞上的免疫受體所識別，這些受體啟動最終導致肝臟損傷的炎癥級聯反應[7]。腸道內定植細菌還會影響脾臟的發(fā)育成熟。新生兒腸道被廣泛的細菌物種定植的過程，誘導了脾臟中胎肝來源B 細胞的快速增殖，同時伴隨著脾臟邊緣區(qū)（Marginal zone，MZ）B 細胞和IgM 漿細胞的快速發(fā)育，從而使得機體能夠對病原體產生適應性免疫應答[8]。

肝臟是人體內臟里最大的器官，以代謝功能為主。肝臟富含各種常駐先天免疫細胞，包括自然殺傷（Natural killer，NK）細胞、枯否細胞（Kupffer cells，KCs）、淋巴細胞和樹突細胞等。肝臟中的炎性巨噬細胞，占體內固定組織巨噬細胞總數的80%～90%。血漿脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）含量顯著增加時，可通過刺激肝臟免疫細胞上的Toll 樣受體4（Toll-like receptors 4，TLR4）引發(fā)全身炎癥，從而引發(fā)其它先天免疫細胞快速募集到肝臟。此外，核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號傳導還會導致肝組織內KCs 和巨噬細胞的活化，從而導致肝臟組織進一步受損[6]。恒定自然殺傷T（Invariant nature killer T，iNKT）細胞存在于肝臟內并且與許多肝臟疾病的發(fā)展有關，在被活化后，iNKT 細胞會導致肝損傷。肝臟功能異常會影響小腸功能[9]。從肝臟分泌到膽汁中的膽紅素進入膽管系統(tǒng)并流入腸道進行排泄，在那里它被微生物分解代謝到腸腔中成為膽素。在對患非酒精性脂肪性肝炎（NASH）的小鼠檢測時發(fā)現，負責將膽汁酸轉運到肝細胞中的溶質載體家族10 成員1（Slc10a1）和溶質載體有機陰離子轉運蛋白家族成員Slco1a1 和Slco1b2 的表達被顯著抑制，且膽汁酸與促炎細胞因子之間存在關聯[10]。膽紅素對尿膽酸的分解代謝可以調節(jié)腸道中的細菌的門或亞種。血清膽紅素水平已顯示與結直腸癌呈負相關[11]。肝臟功能異常同樣會導致脾臟發(fā)生變化。肝硬化等晚期病例的脾臟體積增加，與門靜脈壓力梯度增加和門靜脈高壓癥有關，同時脾臟腫大常見于脂肪肝等肝臟疾病患者[12]。進一步研究發(fā)現，肝硬化患者的脾腫大、纖維化和脾臟僵硬等癥狀與肝臟免疫紊亂有關，其機制主要是由于巨噬細胞受到干擾，并分泌促炎和促纖維化細胞因子[13]。

脾臟的主要功能是通過清除循環(huán)凋亡細胞和維持外周耐受，進而維持免疫穩(wěn)態(tài)。脾臟的白髓區(qū)存在高水平的特化T 細胞和B 細胞，用于產生新的免疫細胞和抗體；并且它作為循環(huán)單核細胞的儲庫，能夠被快速募集到各種炎癥部位。脾臟能夠產生大量促炎和抗炎細胞因子，包括腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）和白介素-6（Interleukin 6，IL-6）等，通過門靜脈直接流入肝臟，從而增強肝臟中自然殺傷細胞活性[6]。脾臟同樣參與腸道免疫調節(jié)。脾臟可充當免疫細胞儲庫，遷移到抗原入口的位點。體外抗原刺激后的抗原特異性脾IgM+B 細胞能夠遷移到受體小鼠的腸中，主要轉換為IgA+漿細胞。此外，口服霍亂病毒可促進小鼠脾B 細胞向腸內遷移，進而轉換為IgA+漿細胞并增殖。去除腸系膜淋巴結（Mesenteric lymph nodes，mLN）會導致脾B 細胞更高水平活化[14]。

目前國際上把腸道和肝臟之間通過膽道、門靜脈和體循環(huán)進行雙向連接的交流稱為 “腸-肝軸”（見圖1），把肝臟與脾臟功能上的相互關聯稱為“肝-脾軸”（見圖2）。當前研究顯示，脾臟和腸道之間也存在著相互聯系（見圖3）。因此，作者團體提出，機體存在腸-肝-脾軸（Intestine-Liver-Spleen Axis，ILS Axis），通過腸道屏障（腸道微生態(tài)）免疫調節(jié)，肝臟維持免疫耐受，脾臟調節(jié)細胞免疫和體液免疫，即通過腸-肝-脾軸維持機體免疫穩(wěn)態(tài)。

2 雙蛋白促進allo-HSCT 患者免疫重建

2.1 allo-HSCT 移植后影響造血及免疫重建的因素

allo-HSCT 前大劑量放、化療不僅嚴重損傷腸道、肝臟、脾臟等器官，而且患者的腸-肝-脾軸被破壞，加劇器官損傷和機體免疫紊亂?；颊咭浦埠竺媾R造血重建和免疫重建，重建延遲則會造成患者免疫功能低下，感染風險增加，是移植相關疾病發(fā)生率和死亡率增加的重要因素[2-3]。

allo-HSCT 移植后造血重建依賴于供體造血干細胞的自我更新能力。炎癥信號分子、腸道微生物群數量和種類的減少等因素會抑制造血干細胞增殖分化[2，17-19]。造血生長因子、抗細胞凋亡細胞因子和抗氧化劑可改善造血干細胞的增殖更新[20]。

圖1 腸肝軸—腸和肝之間的雙向交流Fig.1 Intestine-liver axis：bidirectional communication between the intestine and liver

圖2 肝脾軸—肝臟和脾臟的雙向交流Fig.2 Liver-spleen axis：bidirectional communication between liver and spleen

圖3 腸道和脾臟的雙向交流Fig.3 Two-way communication between the intestine and spleen

GVHD是免疫重建過程中主要且潛在的嚴重并發(fā)癥，是影響T 細胞免疫重建的主要因素。急性GVHD 主要影響皮膚、腸道和肝臟，慢性GVHD 表現出與各種自身免疫疾病相似的多器官浸潤[21]，延遲機體免疫重建，增加機體感染風險，嚴重影響患者的生活質量和生存期。腸道微生物變化和屏障功能損傷可通過TLR4等途徑調節(jié)GVHD 誘導的炎癥反應。破壞機體輔助性T 細胞17（Helper T cell 17，Th17）和FoxP3+CD4+調節(jié)性T細胞（Regulatory T cells，Tregs）的平衡，被認為在GVHD 的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[22-25]。Th17 細胞通過釋放促炎因子IL-17 和TNF-α等，促進T 細胞激活和刺激上皮細胞、內皮細胞等多種細胞產生IL-6等炎性因子，誘發(fā)炎癥反應，促進GVHD；Tregs 主要通過釋放IL-10 和轉化生長因子（Transforming growth factor β，TGF-β）抑制T 細胞和巨噬細胞的增殖活化，同時促進IgA等抗體分泌，抑制GVHD[26]。脾臟Tregs 細胞增加能夠減輕GVHD[27]。臨床研究顯示，allo-HSCT 移植后患者IgA 水平經常降低數月，之后患者開始恢復正常的IgA 水平，然而，急性或慢性GVHD 患者仍然缺乏IgA[18]。研究顯示，短期給藥可通過減少機體內氧化應激降低肝臟中GVHD 相關細胞因子和趨化因子基因表達、循環(huán)IL-17 水平，減輕肝臟炎癥和結腸潰瘍，從而減輕急性GVHD[28]。

2.2 allo-HSCT 患者面臨嚴重營養(yǎng)問題

受免疫重建和并發(fā)癥等影響，allo-HSCT 患者消耗增大，營養(yǎng)需求比常人增加30%～50%。allo-HSCT 患者每天需補充1.5～2.0 g/kg 體重的蛋白質和至少146.5 kJ/kg 體重的卡路里來滿足機體營養(yǎng)需求[29-30]。allo-HSCT 患者移植前及移植過程中身體質量指數（Body Mass Index，BMI）值低于正常水平的患者，即偏瘦患者，其生存率明顯降低[31]。

雖然醫(yī)療工作者會對allo-HSCT 患者進行詳細的營養(yǎng)評估和補充，但是高劑量放化療及藥物副作用等造成的嚴重胃腸道損傷會在很大程度上限制口服攝入，導致營養(yǎng)吸收不良；而且移植期間對患者飲食要求十分嚴格，稍有不慎會導致腸道感染甚至嚴重的GVHD?；谏鲜鲈?，患者經過異基因造血干細胞移植治療后，會出現嚴重的蛋白質能量營養(yǎng)不良，嚴重影響生活質量及生存率[32]。allo-HSCT 患者營養(yǎng)問題成為移植過程中一大困境。

2.3 蛋白營養(yǎng)與機體免疫

當前研究顯示，蛋白營養(yǎng)狀況與機體免疫力密切相關。

1）蛋白營養(yǎng)不良會導致免疫細胞數量的顯著下降，尤其是T 細胞的數量下降。小鼠饑餓8 h后胸腺細胞和脾細胞計數與正常攝食組相比顯著下降。蛋白缺失飼料組小鼠與正常攝食組相比顯示出脾萎縮和T 細胞數量下降[33]。人群試驗顯示出類似的結果。營養(yǎng)不良兒童與營養(yǎng)良好兒童相比，全血中CD4+和CD8+細胞數量顯著降低[34]。

2）蛋白營養(yǎng)不良會降低感染病毒后免疫應答。小鼠在感染流感病毒時，低蛋白飼料組小鼠的病毒特異性抗體應答和流感核蛋白特異性CD8+T 細胞數量均顯著低于蛋白充足飼料組小鼠。低蛋白飼料組小鼠感染流感病毒后病毒作用的持久性，遷移至肺部的炎癥細胞種類和致死率等指標顯著高于蛋白充足飼料組小鼠。將低蛋白飼料更換為蛋白充足飼料則能顯著增加病毒清除率[35]。嬰兒歷什曼蟲感染小鼠，蛋白營養(yǎng)不良會使促進T 細胞從胸腺遷移的分子功能失調[36-37]。

3）蛋白營養(yǎng)干預能夠抑制炎癥反應，提高機體免疫水平。膳食亮氨酸可影響幼年鈍嘴鯛的血漿補體成分3（C3）、免疫球蛋白M（IgM）含量等血漿免疫參數，并通過調節(jié)IL-1β，白介素8（Interleukin 8，IL-8）來降低促炎因子的肝胰腺基因表達[38]。臨床試驗研究顯示，癌癥化療患者給予乳清蛋白能夠增加患者血清白蛋白和IgG 水平[39]。老年人的蛋白攝入推薦量是1.0～1.5 g/kg/d，然而多數老年人不能達到這個膳食蛋白攝入量，老年肌少癥人群補充乳清蛋白和維生素D 能夠減輕慢性低級炎癥[40]。以上研究提示，可通過蛋白臨床營養(yǎng)干預解決allo-HSCT 患者蛋白質營養(yǎng)不良問題。

2.4 雙蛋白應用于allo-HSCT 患者臨床營養(yǎng)干預

雙蛋白是以大豆蛋白等植物蛋白和以牛奶蛋白等動物蛋白為代表的天然優(yōu)質蛋白，按照量效關系和精準互作獲得的食用蛋白源。2017年7月，國務院辦公廳印發(fā) 《國民營養(yǎng)計劃（2017—2030年）》，指出：針對不同人群的健康需求，著力發(fā)展雙蛋白食物等新型營養(yǎng)健康食品。強化雙蛋白工程等重大項目的實施力度。以優(yōu)質動物蛋白、植物蛋白為主要營養(yǎng)基料，加大力度創(chuàng)新基礎研究與加工技術工藝，開展雙蛋白工程重點產品的轉化推廣。此外，雙蛋白已納入國家衛(wèi)生健康委員會2019，2020年《國民營養(yǎng)計劃》的重點工作。

前期動物功效評價實驗顯示，雙蛋白在增加骨骼肌力量，促進支鏈氨基酸釋放，增強抗疲勞能力等方面顯著優(yōu)于單一蛋白[41-44]。為解決allo-HSCT 患者蛋白質營養(yǎng)嚴重缺乏問題，從2016年3月開始，本研究團隊與陸道培醫(yī)院合作開展為期4年多的Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期雙蛋白臨床營養(yǎng)干預，雙蛋白干預組樣本量目前已達40 余例。采用隨機對照研究方法進行雙蛋白作用效果及機制研究，統(tǒng)計分析雙蛋白干預組和未干預組患者干預前、后自身指標變化以及組間變化。I 期干預結果表明：在移植前給予雙蛋白干預1.5 g/d，干預4 周后，雙蛋白依從性良好的患者從移植后到出倉提前4～5 d；從出倉到出院提前10 d。對依從性良好的患者出院追蹤3 個月，尚無患者因治療需要返院。雙蛋白營養(yǎng)干預在提高病床周轉率和抗感染方面取得較顯著成果。

進一步研究發(fā)現，雙蛋白預干預可顯著提高白血病患者的血清白蛋白、球蛋白和總蛋白含量，明顯緩解患者蛋白質營養(yǎng)不良狀況，提高肌肉水平，縮短平均植活時間，降低移植后感染發(fā)生率。此研究成果于2017年發(fā)表于Nutrition Research[45]。由此可見，血液病患者進行allo-HSCT 時，良好基礎狀態(tài)需要合理營養(yǎng)支持，是治療順利進行的重要前提。臨床試驗結果顯示，雙蛋白可以明顯改善骨髓移植患者基礎狀態(tài)和生活質量，對降低感染等并發(fā)癥的發(fā)生起到重要作用[31，45]。

3 雙蛋白促進造血和免疫重建的潛在作用機制

本研究建立小鼠骨髓移植動物模型進行動物功效評價實驗，并結合臨床營養(yǎng)干預試驗，對雙蛋白促進造血、免疫重建的機制進行初步研究[41，45-47]。結果顯示，雙蛋白除提供氨基酸等營養(yǎng)素外，可通過與腸道、肝臟、脾臟等器官的協(xié)同作用改善機體營養(yǎng)狀態(tài)，促進造血干細胞植入，加速造血重建和免疫重建，降低感染風險，減少GVHD等并發(fā)癥發(fā)生率和死亡率。

圖4 骨髓移植過程對腸-肝-脾軸的損傷和雙蛋白對腸-肝-脾軸潛在作用機制圖Fig.4 Injury of the bone marrow transplantation process on the intestine-liver-spleen axis and the potential mechanism of dual-protein on the intestine-liver-spleen axis

3.1 雙蛋白促進免疫重建機制

由于大劑量放療和抗生素等藥物的大量使用，異基因造血干細胞移植的過程通常伴隨腸道菌群失衡和多樣性減少[46]。腸道菌群的多樣性與移植后Tregs 數量、GVHD等并發(fā)癥的發(fā)生率和死亡率呈負相關，腸球菌等腸道菌的相對豐度與之呈正相關[44]。收集雙蛋白干預前、后allo-HSCT 患者大便，進行腸道菌群16S rDNA 測序及其組成分析，結果顯示，雙蛋白能夠明顯改善腸道菌群的組成，提高患者腸道菌群的多樣性，降低腸球菌比例[47]，改善腸道屏障功能，減輕腸道炎癥反應，減少炎癥因子的生成和釋放，降低GVHD等并發(fā)癥的發(fā)生率。其次，動物模型顯示，雙蛋白與單一蛋白相比，能顯著提高大鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）水平，進而增強機體抗氧化能力[41]，可改善放、化療后氧化應激性肝臟損傷，促進肝臟的蛋白合成。臨床試驗顯示，雙蛋白顯著改善allo-HSCT 患者肝臟功能，提高血清白蛋白水平[45]。此外，雙蛋白顯著促進骨髓移植小鼠外周血白細胞、紅細胞、淋巴細胞數量恢復，增加脾臟NK 細胞、T 淋巴細胞和B 淋巴細胞數量，增強IgM等免疫球蛋白的分泌，促進脾臟恢復和免疫重建（另文發(fā)表）。

3.2 雙蛋白與腸-肝-脾軸

根據當前試驗結果，作者團隊推測，雙蛋白通過調節(jié)腸-肝-脾軸來促進allo-HSCT 后機體免疫重建（見圖4）。雙蛋白營養(yǎng)干預一方面通過抑制氧化應激反應，抑制腸道炎癥反應和炎癥因子分泌，抑制小腸細胞凋亡，保護腸道屏障功能，抑制腸道菌群易位和內毒素入血；另一方面雙蛋白改善腸道微生態(tài)，增加有益菌的種類和數量，通過線粒體等途徑增加Tregs 的數量和活性，促進IL-10和TGF-β等抗炎細胞因子分泌，抑制Th17 細胞的活化，增強腸道的免疫耐受，抑制腸道GVHD反應。腸道功能改善可以減輕肝臟的炎癥損傷和免疫激活，同時通過調節(jié)Tregs 和Th17 細胞比例改善脾臟功能，促進脾臟B 細胞發(fā)育成熟，向腸道聚集，并分泌IgA等抗體；腸道免疫耐受增強能夠減少脾臟炎癥因子的分泌，從而減少肝臟免疫系統(tǒng)的激活，減輕肝損傷，改善膽汁酸的分泌，維持腸道微生物的穩(wěn)態(tài)，減輕GVHD，促進造血重建和T 細胞免疫重建，加速患者恢復。

4 結語

雙蛋白食物作為新型營養(yǎng)健康食品，可明顯改善allo-HSCT 患者基礎狀態(tài)及生存質量，縮短治療時間，降低感染率和死亡率，減少醫(yī)療費用，干預效果顯著。結合雙蛋白動物功效評價實驗和臨床營養(yǎng)干預結果，作者團隊首次提出機體可能存在“腸-肝-脾軸” 的免疫互作以及雙蛋白調節(jié)腸-肝-脾軸促進免疫重建的潛在作用機制，目前正在開展進一步驗證工作。