王利民 沈利洪 馬閃珊 張麗英 吳俊琪

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因尚不明確的慢性非特異性免疫性腸道疾病，多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為是由遺傳易感個(gè)體對(duì)腸道微生物的異常黏膜免疫應(yīng)答引起的疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）、克羅恩?。–rohn′s disease，CD）[1]，還有 10%分類不確定的IBD[2]。IBD癥狀表現(xiàn)多樣，腹痛、腹瀉、黏液膿血便為其主要臨床特點(diǎn)[3]，還有很多腸外表現(xiàn)：外周關(guān)節(jié)炎和杵狀指等。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，全球范圍內(nèi)IBD的發(fā)病率均呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病年齡逐漸減小[4-5]。內(nèi)鏡聯(lián)合病變部位病理學(xué)檢查是反應(yīng)IBD疾病活動(dòng)度的金標(biāo)準(zhǔn)[6]，但該方法有一定的禁忌證與局限性，且耗時(shí)長(zhǎng)、患者痛苦大，不能反復(fù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。而血WBC、ESR、CRP等實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)受各種影響因素較多，因此臨床亟需一種創(chuàng)傷小、可靠的生物標(biāo)志物來(lái)監(jiān)測(cè)IBD的活動(dòng)度以指導(dǎo)臨床診治。髓系細(xì)胞觸發(fā)性受體1（triggering receptor on myeloid cells-1，TREM-1）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的用于診斷早期炎癥反應(yīng)的新指標(biāo)，是免疫球蛋白超家族活化受體，選擇性地表達(dá)于血液中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。TREM-1在感染性疾病中發(fā)揮重要作用，通過(guò)其和DNAX激活蛋白12（DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12）結(jié)合，活化下游信號(hào)通路，促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)分泌，具有預(yù)激和誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用。研究顯示，TREM-1不僅在感染性組織中表達(dá)上調(diào)，在非感染性炎癥、結(jié)締組織和腫瘤組織中也表達(dá)上調(diào)[7-8]。另有研究表明IBD患者腸黏膜中TREM-1表達(dá)與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9]。那么血清中TREM-1水平是否也存在同樣關(guān)系？基于此，本研究旨在探討TREM-1在IBD患者血清中的表達(dá)水平及其與疾病活動(dòng)度的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2018年6月至2020年2月金華市中心醫(yī)院收治的IBD患者169例，其中UC患者78例，CD患者91例。另?yè)裢谑罩蔚钠胀ǜ篂a患者40例，健康體檢者40例。各研究對(duì)象均接受結(jié)腸鏡和組織病理學(xué)檢查。IBD患者符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病組《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見》[10]中對(duì)IBD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；依據(jù)結(jié)腸鏡、病理學(xué)檢查結(jié)果和臨床表現(xiàn)綜合評(píng)分分為疾病活動(dòng)期（UC＞3分，CD＞5分）和緩解期（UC≤2分，CD≤4分），依賴激素維持治療符合緩解標(biāo)準(zhǔn)的也納入緩解期。普通腹瀉患者納入標(biāo)準(zhǔn)：大便次數(shù)增多，伴有大便不成形，持續(xù)時(shí)間達(dá)4周以上，經(jīng)結(jié)腸鏡檢查不符合IBD的診斷。健康體檢者為同期來(lái)院體檢人員，大便次數(shù)正常，無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥，并排除使用非甾類抗炎藥和乙醇成癮者。IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者性別、年齡比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者性別、年齡比較

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 酶標(biāo)分析儀RT-6100購(gòu)自深圳Rayto公司；電熱恒溫水浴箱600購(gòu)自上海躍進(jìn)公司；洗板機(jī)BIOTEK ELX50購(gòu)自美國(guó)博騰公司；全自動(dòng)血沉儀IVD購(gòu)自意大利SIRE ANALYTICAL SYSTEMS S.r.l公司；熒光免疫定量分析儀Getein1600購(gòu)自南京基蛋生物公司；血細(xì)胞分析儀XE2100購(gòu)自日本Sysmex公司。人TREM-1試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（試劑批號(hào)：E20190308-11345B）。人鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin，CALP）試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司（試劑批號(hào)：E20190304-10597B）。WBC配套試劑盒購(gòu)自日本 Sysmex公司（試劑批號(hào)：R9531、A9010、G0009），ESR檢測(cè)無(wú)需配套試劑，CRP配套試劑盒購(gòu)自南京基蛋生物公司（試劑批號(hào)：0551210518）

1.2.2 樣本采集 抽取研究對(duì)象清晨空腹外周靜脈血2管，其中1管用EDTA抗凝用于檢測(cè)WBC、ESR及CRP，另1管含有促凝劑，在室溫放置1 h，3 500 r/min離心10 min，取上清液至干燥EP管中，保存至-70℃?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。

1.2.3 參數(shù)測(cè)定 WBC水平檢測(cè)采用血細(xì)胞分析儀XE2100的流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法，ESR水平檢測(cè)采用全自動(dòng)血沉儀IVD的光學(xué)掃描法，CRP水平檢測(cè)采用熒光免疫定量分析儀的免疫熒光干式定量法。血清TREM-1和CALP水平測(cè)定：采用ELISA法；試劑盒從冷藏環(huán)境中取出后在室溫平衡，取出所需板條；設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；樣本孔中加入待測(cè)樣本50 μl，空白孔不加；除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μl，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μl），靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；每孔加入底物 A、B 各 50 μl，37 ℃避光孵育 15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內(nèi)，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的A值；以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的A值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的A值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。

1.3 觀察指標(biāo) （1）比較IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者血清TREM-1水平；（2）分析IBD患者血清TREM-1水平與血 CALP、WBC、ESR、CRP 水平的相關(guān)性；（3）比較 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR 對(duì) UC 活動(dòng)期和CD活動(dòng)期的診斷效能。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)。以疾病活動(dòng)期為變量，采用ROC曲線分析比較TREM-1、CALP、WBC、ESR、CRP 判斷疾病活動(dòng)度的診斷效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者血清TREM-1水平比較 見表2。

由表2可見，UC患者血清TREM-1水平高于普通腹瀉患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。CD患者血清TREM-1水平與普通腹瀉患者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。UC、CD患者血清TREM-1水平高于健康體檢者（均P＜0.05）。UC活動(dòng)期患者血清TREM-1水平遠(yuǎn)高于普通腹瀉患者和健康體檢者（均P＜0.05）。CD活動(dòng)期患者血清TREM-1水平高于普通腹瀉患者和健康體檢者（均P＜0.05）。UC緩解期、CD緩解期患者血清TREM-1水平與普通腹瀉患者、健康體檢者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。UC活動(dòng)期患者與UC緩解期患者、CD活動(dòng)期患者與CD緩解期患者血清TREM-1水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)，活動(dòng)期高于緩解期。

表2 UC、CD組與其他組之間的TREM-1水平比較

2.2 IBD患者血清 TREM-1水平與血CALP、WBC、ESR、CRP水平的相關(guān)性分析 見表3。

表3 血清TREM-1水平與血CALP、WBC、ESR、CRP水平的相關(guān)性分析

由表3可見，UC患者血清TREM-1水平與CALP、WBC、ESR、CRP水平均呈正相關(guān)（均 P＜0．05）。CD 患者血清TREM-1水平與CALP、WBC水平均呈正相關(guān)（均P＜0．05），與 CRP、ESR 水平無(wú)關(guān)（P ＞0.05）。

2.3 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR 對(duì) UC 活動(dòng)期的診斷效能比較 見圖1（插頁(yè)）、表4。

圖1 TREM-1、CALP、WBC、CRP、ESR 診斷 UC 活動(dòng)期的 ROC曲線（TREM-1為髓系細(xì)胞觸發(fā)性受體1；CALP為鈣衛(wèi)蛋白；UC為潰瘍性結(jié)腸炎）

表4 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR對(duì)UC活動(dòng)期的診斷效能比較

由圖1、表4可見，TREM-1取83.091 pg/ml時(shí)，AUC為0.878，診斷UC活動(dòng)期的靈敏度為0.738，特異度為 0.972；CALP 取 76.283 μg/ml時(shí)，AUC 為 0.903，診斷UC活動(dòng)期的靈敏度為0.762，特異度為0.944；ESR取9.5 mm/h時(shí)，AUC為0.626，診斷UC活動(dòng)期的靈敏度為0.810，特異度為0.444；CRP取5.05 mg/L時(shí)，AUC為0.650，診斷UC活動(dòng)期的靈敏度為0.619，特異度為0.639；WBC 取 8.235×109/L 時(shí)，AUC 為 0.686，診斷 UC活動(dòng)期的靈敏度為0.500，特異度為0.833。TREM-1對(duì)診斷UC活動(dòng)期有較高的靈敏度和特異度。

2.4 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR 對(duì) CD 活動(dòng)期的診斷效能比較 見圖2（插頁(yè)）、表5。

圖2 TREM-1、CALP、WBC、CRP、ESR 診斷 CD 活動(dòng)期的 ROC曲線（TREM-1為髓系細(xì)胞觸發(fā)性受體1；CALP為鈣衛(wèi)蛋白；CD為克羅恩?。?/p>

表5 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR對(duì)CD活動(dòng)期的診斷效能比較

由圖2、表5可見，TREM-1取73.470 pg/ml時(shí)，AUC為0.865，對(duì)CD活動(dòng)期診斷的靈敏度為0.588，特異度為 1.000；CALP 取 42.442 μg/ml時(shí)，AUC 為 0.888，對(duì)CD活動(dòng)期診斷的靈敏度為0.882，特異度為0.767；ESR取14.5 mm/h時(shí)，AUC為0.678，對(duì)CD活動(dòng)期診斷的靈敏度為0.882，特異度為0.433；CRP取5.35 mg/L時(shí)，AUC為0.808，對(duì)CD活動(dòng)期診斷的靈敏度為0.706，特異度為 0.600；WBC 取 5.35×109/L 時(shí)，AUC 為 0.767，對(duì)CD活動(dòng)期診斷的靈敏度為0.882，特異度為0.567。TREM-1對(duì)診斷CD活動(dòng)期有較高的靈敏度和特異度。

3 討論

目前臨床診斷IBD的主要方法包括結(jié)腸鏡和內(nèi)鏡下活組織病理學(xué)檢查、臨床疾病活動(dòng)性指數(shù)、ESR、CRP和糞便CALP。CALP是中性粒細(xì)胞和反應(yīng)性的巨噬細(xì)胞胞質(zhì)中重要的蛋白質(zhì)，可作為急性炎性細(xì)胞活化的標(biāo)志物[11]，由于糞便CALP具有抗細(xì)菌降解作用，在腸道中不容易被細(xì)菌分解，糞便CALP在常溫下能夠保持穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)7d，其濃度是血漿中濃度的6倍[12]。然而臨床上糞便采集保存比較困難，并且即使是同一天采集的糞便檢測(cè)結(jié)果相差比較大[13]。而血清標(biāo)志物水平測(cè)定具有取樣方便、可短期內(nèi)重復(fù)檢測(cè)、易于被接受等特點(diǎn)。

IBD是遺傳易感性個(gè)體對(duì)腸道微生物的異常黏膜免疫應(yīng)答引起的伴有嚴(yán)重并發(fā)癥的持續(xù)性腸道炎癥。正常人的腸道黏膜巨噬細(xì)胞很少表達(dá)TREM-l，Schenk等[14]發(fā)現(xiàn)在健康人的腸黏膜單核細(xì)胞上TREM-l的表達(dá)水平顯著低于淋巴結(jié)和扁桃體，在炎癥性腸病大鼠模型中腸黏膜TREM-l表達(dá)上調(diào)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)IBD患者中的血清TREM-l顯著高于健康人[15]。本研究表明血清TREM-1在IBD血清中特異度高，特別是在疾病活動(dòng)期異常升高明顯，IBD活動(dòng)期患者的血清TREM-1水平明顯高于健康體檢者，這與之前的研究結(jié)果相符[9,15]。本研究發(fā)現(xiàn)UC患者血清TREM-1水平與WBC、CPR、ESR的水平呈正相關(guān)，而CD患者血清TREM-1水平只與WBC呈正相關(guān)，與Park等[15]的研究結(jié)果不相符。另外本研究還發(fā)現(xiàn)血清TREM-1水平與臨床上普遍認(rèn)可的判斷IBD活動(dòng)度的CALP水平有很好的相關(guān)性。CD活動(dòng)期、UC活動(dòng)期患者血清TREM-1水平顯著高于緩解期和普通腹瀉患者、健康體檢者，與疾病活動(dòng)程度明顯相關(guān)。以疾病活動(dòng)度為變量，ROC曲線顯示，血清TREM-1水平對(duì)IBD疾病活動(dòng)度具有較高的診斷效能，判斷UC活動(dòng)期和CD活動(dòng)期的最佳臨界點(diǎn)為83.091 pg/ml和 51.241 pg/ml。。

綜上所述，檢測(cè)血清TREM-1水平可助于判斷IBD的疾病活動(dòng)度，具有取樣方便、靈敏度高、特異度高、可短期內(nèi)重復(fù)檢測(cè)、易于被接受等優(yōu)點(diǎn)。血清TREM-1或可為臨床診斷IBD尤其是UC活動(dòng)期、病情及療效觀察提供依據(jù)。