劉暢 張治芬

近年研究認(rèn)為，排卵前促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰可明顯降低卵泡內(nèi)C型尿鈉肽前體（natriuretic peptide precursor type C，NPPC）及環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）表達(dá)水平，使得卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，但LH受體僅位于壁層顆粒細(xì)胞表面，卵丘顆粒細(xì)胞及卵母細(xì)胞表面均無(wú)LH受體[1]，故LH如何將排卵及減數(shù)分裂恢復(fù)的信號(hào)傳至卵母細(xì)胞尚無(wú)定論。

巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）是由單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種特異性生長(zhǎng)因子，屬于造血因子的范疇。1992年Arceci等[2]研究發(fā)現(xiàn)妊娠期輸卵管及子宮均表達(dá)M-CSF，在卵母細(xì)胞、著床前胚胎和胎盤(pán)中亦可檢測(cè)到M-CSF受體（macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CS－FR）的表達(dá)，由此推測(cè)M-CSF參與調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞的成熟。隨后有研究發(fā)現(xiàn)M-CSF基因缺失小鼠發(fā)情周期延長(zhǎng)，成熟卵泡減少，排卵率降低，而給予補(bǔ)充M-CSF后可逆轉(zhuǎn)上述改變[3]，證實(shí)了M-CSF在卵泡發(fā)育成熟及排卵中的重要作用。那么，LH導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)及排卵是否與M-CSF及其受體的信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。以往研究中并未在LH/人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotophin，hCG）峰后觀察M-CSF、M-CSFR、NPPC基因及其編碼的C型尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）表達(dá)的時(shí)間變化曲線。故本研究擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探索hCG促排卵后4 h內(nèi)卵巢組織中M-CSF、M-CSFR及NPPC蛋白及mRNA表達(dá)的變化曲線，探索M-CSF及其受體對(duì)NPPC表達(dá)的影響，推測(cè)其在減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用機(jī)制，為女性排卵障礙的診治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 免疫組化法中兔抗小鼠M-CSF一抗、兔抗小鼠M-CSFR一抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司；二抗（山羊抗兔抗體）和DAB顯色劑購(gòu)于丹麥DAKO公司；熒光定量PCR法中RNeasy miRNA提取試劑盒和引物購(gòu)于美國(guó)Invitrogen生物科技有限公司，其他實(shí)驗(yàn)化學(xué)試劑購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器 RM2016型病理切片機(jī)購(gòu)于上海徠卡儀器有限公司；Nikon Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產(chǎn)品；JB-P5型包埋機(jī)購(gòu)于武漢俊杰電子有限公司；Step one plus型ABI 7500熒光定量PCR儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SFP級(jí)雌性青春期前（25 d齡）C57BL/6小鼠共15只，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0016]，飼養(yǎng)于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心 [實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)碼：SYXK（浙）2014-0008]。

1.4 小鼠模型的建立 小鼠腹腔注射5 U孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）進(jìn)行預(yù)處理，促進(jìn)卵泡發(fā)育；48 h后腹腔注射5 U hCG誘發(fā)排卵，注射后 0、0.5、1、2、4 h分別處死小鼠 3只并做好標(biāo)記，以眼科剪快速取出卵巢組織，避免用手或鑷子擠壓。一側(cè)卵巢組織立即投入10%甲醛固定液中浸沒(méi)并編號(hào)，待HE染色和免疫組化法分析其M-CSF、MCSFR、CNP蛋白表達(dá)情況；另一側(cè)卵巢組織分離后立即-80℃冰凍保存，以備熒光定量PCR檢測(cè)。動(dòng)物飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理和使用指南》的規(guī)定。

1.5 HE染色觀察卵巢組織中各級(jí)卵泡的發(fā)育情況卵巢組織固定24 h后常規(guī)HE染色（切片厚度5 μm），光鏡下觀察卵巢組織內(nèi)各級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)特征。

1.6 免疫組化法檢測(cè)卵巢組織中NPPC、M-CSF及MCSFR的蛋白表達(dá) 將卵巢組織石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，3%過(guò)氧化氫（H2O2）室溫避光孵育20 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，再以pH=7.4的PBS洗滌。以含5% FBS白蛋白稀釋一抗，稀釋比例1：200，于4℃孵育過(guò)夜。玻片洗滌后滴加二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色，Harris蘇木素復(fù)染，脫水后中性樹(shù)膠封片。選取包含排卵前卵泡的卵巢組織切片為計(jì)算對(duì)象，隨機(jī)挑選3個(gè)200倍視野拍照。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.USA）軟件，選取相同的棕黃色作為陽(yáng)性判斷的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，分析出陽(yáng)性區(qū)域累積光密度值（integrate optical density，IOD），根據(jù)圖片中卵巢組織所占面積（AREA），通過(guò)公式IOD/AREA，計(jì)算平均光密度值。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)卵巢組織中NPPC、M-CSF及M-CSFR的mRNA表達(dá) 取出凍存標(biāo)本，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作流程，使用RNeasy miRNA提取試劑盒分離提取RNA，通過(guò)熒光定量PCR儀分別測(cè)定NPPC、M-CSF及M-CSFR的mRNA表達(dá)水平，內(nèi)參基因選擇Rpl19。引物合成于武漢谷歌生物科技有限公司，引物序列見(jiàn)表1。所有檢測(cè)至少重復(fù)3次。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，各時(shí)點(diǎn)間比較采用One-Way ANOVA。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 排卵前卵泡發(fā)育情況 卵巢組織切片HE染色后可見(jiàn)竇前卵泡（preantral follicle，PF）、竇卵泡（antral fol－licle，AF）。成熟卵泡內(nèi)各部分結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，其中卵泡最外層的線性結(jié)構(gòu)為卵泡膜，緊貼卵泡膜分布的顆粒細(xì)胞為壁層顆粒細(xì)胞（mural granulosa cells，mGCs），mGCs內(nèi)側(cè)緊貼卵母細(xì)胞（Oocyte，Oo）的顆粒細(xì)胞為卵丘顆粒細(xì)胞（cumulus cells，CCs），mGCs與 CCs之間的空腔為卵泡腔（follicullar antrum，F(xiàn)A），內(nèi)充滿卵泡液，位于CCs中央的是Oo。CCs與Oo形成的復(fù)合體稱卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（cumulus-oocyte complex，COC），見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。卵巢組織中卵泡發(fā)育不同階段，各階段卵泡及卵泡內(nèi)結(jié)構(gòu)均可見(jiàn)，說(shuō)明促排卵小鼠模型建立成功。

圖1 小鼠卵巢組織中各級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)（HE染色，×100）

2.2 卵巢組織中M-CSF、M-CSFR及NPPC蛋白的表達(dá)定位 免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)M-CSF及M-CSFR在卵泡中mGCs、CCs均有表達(dá)；CNP主要由mGCs表達(dá)，尤其是與CCs相連部分的mGCs中表達(dá)較明顯，CCs也有少量表達(dá)，見(jiàn)圖2-4（插頁(yè)）。

圖2 M-CSF在卵巢組織中的表達(dá)（HE染色，×100）

圖3 M-CSFR在卵巢組織中的表達(dá)（HE 染色，×100）

圖4 CNP在卵巢組織中的表達(dá)（HE 染色，×200）

2.3 卵巢組織中各時(shí)點(diǎn)M-CSF、M-CSFR及CNP蛋白表達(dá)水平的變化 促排卵后小鼠卵巢組織中M-CSF蛋白表達(dá)水平于2、4 h明顯下降，與其他時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），M-CSFR蛋白表達(dá)水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，各時(shí)點(diǎn)平均光密度值之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。此外，CNP表達(dá)水平在1、2 h顯著增高，與其他時(shí)點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05），而 0、0.5、4 h之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖 5。

2.4 卵巢組織中各時(shí)點(diǎn) M-CSF、M-CSFR及 NPPC mRNA的表達(dá)水平變化 促排卵后小鼠卵巢組織中NPPC mRNA表達(dá)水平1、2 h顯著升高，與其他時(shí)點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而M-CSF、MCSFR mRNA在注射hCG后均呈持續(xù)低水平表達(dá)，各時(shí)點(diǎn)之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)圖6。

圖5 卵巢組織中各時(shí)點(diǎn)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體（M-CSFR）及C型尿鈉肽（CNP）蛋白表達(dá)水平的變化（注：與其他時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05）

3 討論

集落刺激因子家族（colony-stimulating factors，CSFs）是一組18～70 kDa的不穩(wěn)定糖蛋白，主要包括3種：M-CSF，亦稱CSF-1；粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF），亦稱CSF-2；粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF），亦稱 CSF-3。M-CSF可提高吞噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞和微生物的能力，還作用于生殖細(xì)胞，影響卵巢功能，促進(jìn)胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)育、協(xié)助胚胎生長(zhǎng)等，參與機(jī)體生殖內(nèi)環(huán)境平衡的維持。有研究發(fā)現(xiàn)，M-CSF可促進(jìn)卵泡發(fā)育及排卵，并增加顆粒細(xì)胞的增殖能力[3]。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)促排卵小鼠卵泡內(nèi)M-CSF及其受體分布廣泛，mGCs及CCs均有表達(dá)，故推測(cè)其在卵泡發(fā)育成熟及減數(shù)分裂恢復(fù)的過(guò)程中很有可能起著重要的作用。

本研究從蛋白及mRNA兩方面測(cè)定卵巢組織中M-CSF表達(dá)水平，結(jié)果提示在hCG刺激后，M-CSF表達(dá)呈下降趨勢(shì)，直至較低水平。以往研究表明，正常月經(jīng)周期卵泡發(fā)育過(guò)程中，血清M-CSF及其受體表達(dá)呈上升趨勢(shì)，并在排卵日達(dá)到峰值[4]，這與逐漸升高的雌激素及促性腺激素水平相關(guān)[5]，Zhang等[6]的研究也提出類似結(jié)論。在卵泡發(fā)育早中期，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）刺激顆粒細(xì)胞分泌雌二醇（estradiol，E2）和M-CSF，不斷增加的E2水平反過(guò)來(lái)刺激卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌M-CSF。而M-CSF可能與FSH存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)卵泡發(fā)育及雌激素的分泌；到了卵泡晚期，隨著體內(nèi)雌激素濃度的進(jìn)一步上升，抑制了M-CSF的分泌，以減弱其與FSH的協(xié)同作用，防止卵泡的過(guò)度生長(zhǎng)，同時(shí)避免M-CSF的其他生物學(xué)效應(yīng)，從而維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。結(jié)合本研究，推測(cè)高劑量的LH/hCG刺激后，卵泡內(nèi)M-CSF及其受體水平表達(dá)持續(xù)下降至低水平，這與LH峰之前雌激素峰以及LH峰后低雌激素水平相關(guān)。

圖6 卵巢組織中各時(shí)點(diǎn)巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子受體（M-CSFR）及C型尿鈉肽前體（NPPC）mRNA表達(dá)水平的變化（注：與其他時(shí)點(diǎn)比較，*P＜0.05）

本實(shí)驗(yàn)中還通過(guò)免疫組化定位CNP的表達(dá)，結(jié)果顯示卵巢組織中CNP主要表達(dá)于mGCs上，同時(shí)CCs上亦有少量表達(dá)。這與以往的研究有所偏差，之前認(rèn)為CNP僅表達(dá)于mGCs表面[6]，考慮由于免疫組化法結(jié)果與實(shí)驗(yàn)人員主觀判斷相關(guān)性較大，進(jìn)一步可以行卵泡內(nèi)原位雜交PCR法以確認(rèn)。

mGCs中CNP與CCs上鈉尿肽受體 2（natriuretic peptide receptor 2，NPR2）結(jié)合后，刺激CCs合成并分泌cGMP。體外培養(yǎng)COCs時(shí)加入NPPC，可發(fā)現(xiàn)CCs和Oo內(nèi)的cGMP含量升高，從而阻止生發(fā)泡破裂[7]。還有一項(xiàng)動(dòng)物研究顯示，NPPC或者NPR功能缺失或基因敲除的小鼠體內(nèi)Oo往往會(huì)出現(xiàn)早發(fā)的減數(shù)分裂恢復(fù)[6]。以上研究結(jié)果均證實(shí)，NPPC以及其同源性受體NPR2在維持減數(shù)分裂停滯中具有重要作用。有研究運(yùn)用RT-PCR分析顯示，小鼠卵泡液中NPPC mRNA及CNP蛋白表達(dá)水平均隨著卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育而呈上升趨勢(shì)[8]。近些年國(guó)內(nèi)外研究已初步認(rèn)可以NPPC/NPR2系統(tǒng)為核心的減數(shù)分裂調(diào)控模型，認(rèn)為L(zhǎng)H峰可抑制卵巢顆粒細(xì)胞分泌CNP，減少CNP與NPR2結(jié)合，減少cGMP的合成，從而促進(jìn)減數(shù)分裂恢復(fù)[6]。且有研究指出，LH峰后2～3 h可見(jiàn)CNP明顯下降[9]。本研究中從mRNA與蛋白水平分別測(cè)定hCG促排卵后4 h內(nèi)NPPC/CNP水平變化發(fā)現(xiàn)，在hCG注射后1 h，NPPC mRNA水平達(dá)高峰后隨即快速下降，2 h時(shí)CNP水平達(dá)高峰，隨后亦快速下降至較低水平，這與上述研究結(jié)果一致，提示LH/hCG可能通過(guò)某途徑下調(diào)NPPC/CNP以啟動(dòng)減數(shù)分裂恢復(fù)。而hCG刺激后短時(shí)間內(nèi)NPPC/CNP表達(dá)增加，考慮是其在卵泡期表達(dá)趨勢(shì)的延續(xù)，如成熟促進(jìn)因子等的作用結(jié)果。筆者推測(cè)排卵前卵巢組織中NPPC基因水平的變化曲線與外周血雌激素、LH變化曲線相類似，CNP蛋白水平在LH/hCG峰后2 h出現(xiàn)峰值，隨后快速下降至較低水平，繼而影響卵泡內(nèi)cGMP及環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，最終導(dǎo)致 Oo 生發(fā)泡破裂及排卵。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示在促排卵小鼠卵巢組織中，M-CSF及M-CSFR分布廣泛，在mGCs及CCs中均有表達(dá)，而CNP主要表達(dá)于mGCs，CCs中僅少量表達(dá)。在LH/hCG促排卵后卵巢組織中M-CSF、M-CSFR水平隨即出現(xiàn)下降趨勢(shì)，NPPC mRNA呈上升趨勢(shì)并在1 h達(dá)高峰后顯著下降，CNP蛋白在2 h上升至峰值后隨即快速下降至較低水平，推測(cè)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)前期NPPC mRNA水平在LH/hCG峰刺激下上升至峰值后下降，其變化曲線與外周血雌激素及LH類似。