馬君 陳洋 牟一平

胃癌是世界上第二大癌癥死亡的原因，在包括中國和日本在內(nèi)的亞洲國家中，胃癌的發(fā)病率特別高。據(jù)報道，全球范圍內(nèi)盡管胃癌的發(fā)病率在逐年下降，但每年仍有超過100萬的新診斷病例和85萬的死亡病例[1]。胃癌高病死率的主要原因在于其早期無明顯臨床癥狀，多數(shù)患者確診時已處于晚期，導(dǎo)致臨床治療效果不佳，預(yù)后差[2]。大量文獻(xiàn)表明，異常miRNA表達(dá)與胃癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3-4]。近年來有研究顯示，miRNA可通過干擾腫瘤抑制因子和促進(jìn)癌基因的表達(dá)導(dǎo)致功能異常，這與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)[5]。此外，miRNA的功能障礙還可導(dǎo)致下游表型的變化，包括細(xì)胞遷移、侵襲、增殖和凋亡等過程[5]。miRNA可通過與靶基因完全或不完全結(jié)合導(dǎo)致靶mRNA降解。多項研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA或者環(huán)狀RNA通過調(diào)控miR-328-5p的表達(dá)參與非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌等多種腫瘤的惡性進(jìn)展，并有希望成為臨床診斷的標(biāo)志物[6-7]。然而其在胃癌中的作用尚未見報道，基于此，本研究將探討miR-328-5p對胃癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用及其具體的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 30只雄性C57BL/6J小鼠（體重：22～25g，年齡：6～7周齡）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物使用許可證：北京 SYXK（京）2017-0033。小鼠自由飲水進(jìn)食，晝夜各12 h。人源胃黏膜上皮細(xì)胞系GES-1以及胃癌細(xì)胞系SGC7901、MKN28均購自上海澳音生物科技有限公司。miR-328-5p和miR-con（批號：121547）均購自上海美軒生物科技有限公司；Transwell小室（批號：845116）購自吳江康寧生命科學(xué)有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號：215548）購自武漢純度生物科技有限公司；脊椎蛋白2（SPON2）兔單抗（批號：s1121）、波形蛋白（Vimentin）兔單抗（批號：s87516）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）兔單抗（批號：s8361）均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，酪氨酸蛋白激酶（Src）兔單抗、磷酸化 Src（p-Src）兔單抗（批號：b2158）、局部黏著斑激酶（FAK）兔單抗（批號：b0542）、磷酸化 FAK（p-FAK）兔單抗（批號：b9564）均購自杭州戴格生物技術(shù)有限公司，GAPDH作為內(nèi)參。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組及胃癌模型構(gòu)建 將30只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為胃癌組和正常組，每組15只。胃癌組小鼠采用N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）化學(xué)誘導(dǎo)法構(gòu)建小鼠胃癌模型，具體操作為：在小鼠飲用水里添加MNU，以120 mg/L濃度持續(xù)處理4周，即可誘導(dǎo)小鼠胃組織發(fā)生癌變[8]。

1.2.2 小鼠胃組織中miR-328-5p、SPON2相對表達(dá)量檢測 取兩組小鼠胃組織，提取RNA，進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)為cDNA，采用RT-PCR法檢測miR-328-5p、SPON2相對表達(dá)量。引物購自上海生工生物工程股份有限公司。反應(yīng)程序：94℃變性 20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)32個。其相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算。

1.2.3 小鼠胃組織中p-Src、Src、p-FAK、FAK蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot法。取小鼠胃癌及正常胃組織，采用強(qiáng)組織蛋白裂解液裂解胃癌及正常胃組織蛋白，采用BCA法檢測兩組蛋白濃度，定量后取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后利用5%的牛奶室溫封閉1 h去除非特異性抗原，隨后加入對應(yīng)配制好的一抗中于4℃孵育過夜，抗體稀釋比均為1：1 000。次日利用辣根過氧化物酶化學(xué)二抗室溫孵育1 h后進(jìn)行化學(xué)曝光，利用化學(xué)掃膜儀分析數(shù)據(jù)。

1.2.4 胃癌細(xì)胞分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將胃癌細(xì)胞系SGC7901置于1640完全培養(yǎng)基（1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10% FBS+1%雙抗）中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時進(jìn)行傳代鋪板。將細(xì)胞分為miR-328-5p組、miR-con組、NC組共3組。其中miR-328-5p組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-328-5p，miR-con組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-con，NC組不轉(zhuǎn)染。將SGC7901細(xì)胞鋪板于6孔板中，按照lipo 2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染6 h后換液，24 h后消化細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.5 3組胃癌細(xì)胞miR-328-5p、Vimentin和MMP-9表達(dá)水平檢測 細(xì)胞按照上述分組處理24 h后，提取細(xì)胞RNA，采用RT-PCR法檢測miR-328-5p、Vimentin、MMP-9相對表達(dá)量，其相對表達(dá)量采用2-△△Ct法計算，以U6作為內(nèi)參。每組實驗設(shè)計6個復(fù)孔。

1.2.6 3組胃癌細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)檢測 采用Transwell小室實驗。細(xì)胞按照上述分組處理24 h后，用胰酶消化細(xì)胞，經(jīng)過離心后采用無血清基礎(chǔ)1 640培養(yǎng)基重懸計數(shù)后，稀釋成4×106個/ml的細(xì)胞懸液，取100 μl鋪板于 Transwell上室，下室加入 600 μl含血清完全培養(yǎng)基。上下室共培養(yǎng)24 h后，采用4%多聚甲醛固定15 min后，用棉簽將上室未遷移的細(xì)胞擦拭干凈，結(jié)晶紫染色，拍照計算細(xì)胞遷移數(shù)。細(xì)胞侵襲實驗則提前將Transwell上室包被基質(zhì)膠，后續(xù)操作同遷移實驗步驟，拍照計算細(xì)胞侵襲數(shù)。每組實驗設(shè)計6個復(fù)孔。

1.2.7 miR-328-5p、miR-con胃癌細(xì)胞SPON2基因野生型（WT）和突變型（MUT）熒光素酶相對活力值檢測 采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?。Targetscan 7.2軟件分析miR-328-5p直接靶向SPON2基因3′UTR序列后，設(shè)計該靶點(diǎn)突變報告基因質(zhì)粒。報告基因?qū)嶒灧譃閙iR-con+SPON2 WT組、miR-328-5p+SPON2 WT組、miR-con+SPON2 MUT組、miR-328-5p+SPON2 MUT組共4組，其中miR-con+SPON2 WT組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-con和SPON2 WT質(zhì)粒，miR-328-5p+SPON2 WT組細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-328-5p和 SPON2 WT質(zhì)粒，miR-con+SPON2 MUT組細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-con和SPON2 MUT質(zhì)粒，miR-328-5p+SPON2 MUT組轉(zhuǎn)染miR-328-5p和SPON2 MUT質(zhì)粒。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24 h，取出細(xì)胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒裂解細(xì)胞并進(jìn)行后續(xù)實驗，最后用酶標(biāo)儀檢測并計算熒光素酶相對活力值。每組實驗設(shè)計6個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠胃組織中miR-328-5p、SPON2相對表達(dá)量比較 與正常組比較，胃癌組胃組織中miR-328-5p相對表達(dá)量明顯降低，SPON2相對表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 兩組小鼠胃組織中miR-328-5p、SPON2相對表達(dá)量比較

2.2 兩組小鼠胃組織中p-Src、Src、p-FAK、FAK蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，胃癌組胃組織中p-FAK、p-Src蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 磷酸化酪氨酸蛋白激酶（p-Src）、酪氨酸蛋白激酶（Src）、磷酸化局部黏著斑激酶（p-FAK）、局部黏著斑激酶（FAK）蛋白表達(dá)的電泳圖

表2 兩組細(xì)胞p-Src、Src、p-FAK、FAK蛋白表達(dá)水平比較

2.3 3組胃癌細(xì)胞miR-328-5p、Vimentin和MMP-9相對表達(dá)量比較 與NC、miR-con組比較，miR-328-5p組miR-328-5p相對表達(dá)量明顯升高，同時Vimentin、MMP-9相對表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表3。

表3 3組細(xì)胞miR-328-5p、Vimentin和MMP-9相對表達(dá)量比較

2.4 3組胃癌細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)比較 與NC、miR-con組比較，miR-328-5p組細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表4。

表4 3組細(xì)胞遷移、侵襲數(shù)比較（個）

2.5 4組胃癌細(xì)胞熒光素酶相對活力值比較 與miR-328-5p+SPON2 WT組比較，miR-con+SPON2 WT組、miR-con+SPON2 MUT組、miR-328-5p+SPON2 MUT組熒光素酶相對活力值均明顯為高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0.05）。見圖 2、表 5。

圖2 miR-328-5p靶向SPON2基因3'UTR序列

表5 miR-328-5p對SPON2雙熒光素酶報告基因熒光素酶相對活力值檢測

3 討論

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其特征是進(jìn)展迅速、預(yù)后差和5年生存率低。迄今為止，早期檢測胃癌是降低胃癌病死率的最佳方法。由于內(nèi)鏡檢查存在相關(guān)的不良反應(yīng)（包括穿孔，吸入性肺炎或出血），因此內(nèi)鏡檢查在社區(qū)中并不普及。因此，尋求獲取方便、易于檢測的生物標(biāo)志物將有利于胃癌的早期檢測[9]。

miRNA參與調(diào)控包括細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、分化、發(fā)育等多種生物學(xué)過程。越來越多的證據(jù)表明，多種miRNA在癌組織和正常組織中差異表達(dá)，并對miRNA在各種類型癌癥中的分布進(jìn)行了分析，提出了miRNA在臨床應(yīng)用中的診斷和預(yù)后價值[10]。對于miR-328-5p此前已有文章報道m(xù)iR-328-5p可通過靶向糖基化終產(chǎn)物受體抑制MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖[11]，此外CircRNA-5692可通過刺激miR-328-5p增強(qiáng)殘疾基因同源物2相互作用蛋白表達(dá)從而來抑制肝癌的進(jìn)展[12]。長鏈非編碼RNA TPTEP1競爭性抑制miR-328-5p從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。本研究通過構(gòu)建小鼠原位胃癌模型，發(fā)現(xiàn)miR-328-5p在胃癌組織中表達(dá)明顯低于正常胃組織，而SPON2在胃癌組織中表達(dá)明顯高于正常胃組織。通過遷移和侵襲實驗發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-328-5p可抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲。通過Targetscan分析發(fā)現(xiàn)miR-328-5p可能靶向SPON2 3′UTR序列，該結(jié)論進(jìn)一步通過熒光素酶報告基因得到驗證。

SPON2是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，由SPON2基因編碼，早期研究發(fā)現(xiàn)與SPON2相關(guān)的疾病包括藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡，探其致病機(jī)制發(fā)現(xiàn)SPON2主要影響整合素活化及蛋白質(zhì)代謝[13-14]。近年來SPON2在腫瘤中的作用越來越得到重視，在大腸癌中，SPON2表達(dá)明顯上調(diào)，并通過缺口受體信號參與腫瘤的惡性進(jìn)程[15]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-328-5p靶向SPON2后可能通過調(diào)控FAK/Src信號通路的活化，抑制了Vimentin、MMP-9等細(xì)胞遷移相關(guān)分子的表達(dá)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-328-5p在胃癌中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-328-5p抑制胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)miR-328-5p可能通過靶向抑制SPON2的表達(dá)，從而抑制了FAK/Src信號的活化及下游細(xì)胞遷移相關(guān)蛋白Vimentin、MMP-9的表達(dá)。因此miR-328-5p有望成為胃癌臨床診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。