孫淑敏，馬衛(wèi)賓，衛(wèi) 敏，李 倩，謝巖黎?

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEA）是一種由鐮刀菌產(chǎn)生的雌激素類毒素[1]，主要污染小麥、玉米等農(nóng)作物原料及其制品，具有較強(qiáng)的生殖毒性、致突變和致畸作用，還能引起雌性激素中毒癥及誘發(fā)腫瘤[2]。因此亟需尋求簡便高效的食品中ZEA檢測方法，保障食品安全和消費(fèi)者健康。

常規(guī)的玉米赤霉烯酮快速檢測方法主要包括酶聯(lián)免疫法和試紙條法[3-4]。但是這些依賴于抗體的免疫學(xué)方法存在抗體制備周期長，成本高，不易保存等缺陷[5]。核酸適體作為一種新型的識(shí)別分子，具有特異性強(qiáng)，可人工大量合成，成本低，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)[6]。尤其是對(duì)缺乏抗原的小分子污染物，其比抗體更具有優(yōu)勢(shì)。目前，在真菌毒素領(lǐng)域，主要針對(duì)赭曲霉毒素和黃曲霉毒素，構(gòu)建了一系列基于適配體的電化學(xué)方法、熒光法及比色法[7-9]。其中比色法具有操作簡便、顯色快速、結(jié)果可視化，具有良好的應(yīng)用前景。納米金因具有高消光系數(shù)、距離依賴效應(yīng)和易合成等特點(diǎn)，是比色法中最常用的顯色探針[10]。近幾年，圍繞納米金（AuNPs）開發(fā)了各種各樣的比色檢測方法，用于食品中農(nóng)藥殘留[11]、抗生素[12]、真菌毒素[13]及病原微生物[14]的快速檢測。目前，納米金比色法的原理主要有雙鏈 DNA保護(hù)法、單鏈DNA保護(hù)法、正電荷聚合物法、交聯(lián)法以及解交聯(lián)法[15]。其中單鏈 DNA保護(hù)法直接利用單雙鏈DNA與未修飾的納米金之間的靜電吸附能力差異實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)[16-18]，無需進(jìn)行修飾和輔助儀器，簡單易行。但是，比色法的靈敏度通常低于熒光法和電化學(xué)等傳感方法，因此需要通過信號(hào)放大體系進(jìn)一步提高比色方法的靈敏度。

本研究以未修飾的納米金（AuNPs）為傳感指示劑，玉米赤霉烯酮適配體為信號(hào)識(shí)別元件，銀染技術(shù)為信號(hào)放大策略，開發(fā)了一種新型快速、高靈敏度的玉米赤霉烯酮比色傳感器。該方法可應(yīng)用于谷物和食用油中ZEA的快速檢測，為食品中ZEA的污染控制提供了新的檢測途徑。

1 材料與方法

1.1 主要材料

玉米赤霉烯酮適體（5'-GAT GGG GAA AGG GTC CCC CTG GGT TGG AGC ATC GGA CA-3'）：生工生物工程（上海）股份有限公司合成；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品（ZEA）、黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品（AFB1）、赭曲霉A標(biāo)準(zhǔn)品（OTA）：Sigma公司；ZEA酶聯(lián)免疫試劑盒：上?？祆`生物科技有限公司；福臨門玉米油、玉米糝、玉米粒：超市購買；實(shí)驗(yàn)所使用水均為超純水。實(shí)驗(yàn)中有機(jī)溶劑均為色譜純，其他實(shí)驗(yàn)材料為分析純。

RT-6000型酶標(biāo)分析儀：深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；Epoch型微孔板掃描分光光度計(jì)：美國伯騰儀器有限公司；HT7700型透射電鏡：日本日立高新有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-6100S型紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 納米金和銀染液的制備

檸檬酸三鈉還原法制備13 nm粒徑納米金[19]：將HAuCl4配制成1 mmol/L水溶液，取100 mL加熱至沸，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入10 mL 38.8 mmol/L檸檬酸三鈉溶液，加熱煮沸15 min。此時(shí)可觀察到溶液由淡黃色很快變?yōu)榛疑?，轉(zhuǎn)而變?yōu)楹谏?，逐漸穩(wěn)定成紅色。冷卻至室溫后，用超純水恢復(fù)至原體積。將所制備的AuNPs經(jīng)透射電鏡和紫外–可見光譜分析進(jìn)行表征。

參考李向麗等[20]的方法分別配置銀染增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)中的引發(fā)液和增強(qiáng)液。引發(fā)液的配制如下：準(zhǔn)確稱量對(duì)苯二酚1.7 g，加入超純水30 mL溶解，與60 mL 1%明膠、10 mL檸檬酸緩沖液（pH 3.5）充分混勻。增強(qiáng)液配制時(shí)準(zhǔn)確稱量硝酸銀0.5 g，加入超純水2 mL溶解。

1.2.2 檢測原理

ZEA適配體可以通過靜電作用吸附在AuNPs顆粒表面上，使得納米金在高鹽濃度下仍保持分散穩(wěn)定，顯色呈紅色，且由于適配體的保護(hù)作用，納米金無法催化 Ag+還原成單質(zhì)銀，銀染后不會(huì)出現(xiàn)黑色的銀染信號(hào)；而加入ZEA后，ZEA適體與ZEA發(fā)生特異性結(jié)合而從納米金表面解吸，在高鹽環(huán)境中AuNPs發(fā)生誘導(dǎo)聚集，顏色由紅色變?yōu)樽仙蛩{(lán)色，而裸露的納米金表面可以催化Ag+還原成單質(zhì)銀而在納米金周圍形成銀染放大信號(hào)，因此反應(yīng)體系顏色和吸光度值大小與ZEA的濃度有關(guān)。見圖1。

圖1 納米金比色法檢測ZEA的原理圖

1.2.3 納米金比色法的可行性研究

為考察納米金比色法的可行性，分別設(shè)置 3組實(shí)驗(yàn)，第一組實(shí)驗(yàn)僅在酶標(biāo)板孔中加入100 μL納米金和10 μL NaCl溶液，加入PBS緩沖液使總體積為210 μL；第二組實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)板孔中依次加入100 μL納米金液體和50 μL適體，孵育5 min后加入10 μL NaCl溶液，加入PBS緩沖液使總體積為210 μL；第三組實(shí)驗(yàn)在酶標(biāo)板孔中依次加入100 μL納米金液體和50 μL適體，孵育5 min后加入50 μL濃度 50 ng/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，繼續(xù)孵育5 min，最后加入10 μL NaCl溶液。分別測定三組溶液在波長520 nm和650 nm處的吸光度值。

1.2.4 NaCl濃度的優(yōu)化

在酶標(biāo)板孔中加入 50 μL 1 μmol/L 適體和100 μL AuNPs，孵育 5 min 后，加入 50 μL 濃度50 ng/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，繼續(xù)孵育5 min，分別加入濃度為0.1、0.5、1、2、3、4、5 mol/L的NaCl溶液，反應(yīng)5 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。

1.2.5 適體濃度的優(yōu)化

在酶標(biāo)板孔中分別加入 50 μL 濃度梯度為0.05、0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L 適體和 100 μL AuNPs，孵育5 min后加入50 μL 50 ng/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，孵育5 min后加入5 mol/L的NaCl溶液，反應(yīng)5 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。

1.2.6 納米金與適體反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化

在酶標(biāo)板孔中分別加入50 μL 1 μmol/L適體和 100 μL AuNPs，孵育 5 min 加入 50 μL 50 ng/mL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，繼續(xù)孵育5 min后加入濃度為5 mol/L的NaCl溶液，分別反應(yīng)5、10、20、30、40、50、60 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。

1.2.7 玉米赤霉烯酮的檢測

在酶標(biāo)板孔中加入50 μL 1 μmol/L ZEA適體和100 μL AuNPs，孵育5 min后分別加入50 μL濃度為5、10、50、100、200 ng/mL ZEA標(biāo)準(zhǔn)品，繼續(xù)孵育5 min后加入10μL 5 mol/L NaCl溶液，孵育5 min后測定520 nm和650 nm波長處的吸光度值。平行實(shí)驗(yàn)3次。以A650/A520值為縱坐標(biāo)，ZEA濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.8 方法的特異性分析

在酶標(biāo)板孔中加入 50 μL 1 μmol/L適體和100 μL AuNPs，孵育 5 min 后分別加入 50 μL 的50 ng/mL OTA標(biāo)準(zhǔn)品、50 ng/mL AFB1標(biāo)準(zhǔn)品、50 ng/mL ZEA標(biāo)準(zhǔn)品、10 mmol/L 金屬離子（Ca2+，K+，Cu2+，F(xiàn)e3+），繼續(xù)孵育 5 min 后加入5 mol/L的NaCl溶液，孵育5min后測定520 nm和650 nm處的吸光度值。

1.2.9 銀染增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)

將銀染增強(qiáng)液和引發(fā)液在銀染前 30 min 置于4 ℃儲(chǔ)存，銀染時(shí)取20 μL增強(qiáng)液加入1 mL引發(fā)液中，迅速混勻后立即每孔加入 100 μL反應(yīng)，記錄630 nm波長處的吸光度值。銀染增強(qiáng)過程在避光或弱光下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中考察銀染時(shí)間對(duì)顯色結(jié)果的影響。

1.2.10 樣品檢測驗(yàn)證

根據(jù)國標(biāo) GB/T 23504—2009中糧食及糧食制品的處理方法，對(duì)市售玉米處理，得到濾液為實(shí)際樣品液；根據(jù)孟衛(wèi)芹[21]對(duì)玉米油的處理方法，得到濾液為實(shí)際樣品液。在最優(yōu)檢測條件下，分別對(duì)加標(biāo)濃度為10、50和100 ng/mL的玉米油和玉米樣品進(jìn)行檢測。記錄吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的理論值計(jì)算回收率，檢驗(yàn)納米金比色法對(duì)實(shí)際樣品檢測的可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米金的表征

從圖2a可知，制備出的納米金粒子的粒徑大小較為一致，粒徑大小約為 13 nm，成均勻分散的球形，其在波長520 nm處產(chǎn)生了最高吸收峰，溶液呈紅色。而在加入高濃度鹽溶液后（圖2b），AuNPs變成了團(tuán)聚狀態(tài)，溶液顏色為紫藍(lán)色。其最大吸收波長紅移至650 nm左右。

圖2 不同狀態(tài)下納米金粒子的TEM圖.（a）納米金；（b）高鹽環(huán)境下的納米金

2.2 納米金比色法的可行性分析

由圖3可發(fā)現(xiàn)，在高鹽環(huán)境中，納米金在ZEA適體的保護(hù)下免于聚集，體系的吸光度和顏色均未發(fā)生明顯變化，而在加入ZEA后，ZEA適體與ZEA的特異性結(jié)合使納米金暴露在高鹽溶液下，發(fā)生聚集反應(yīng)，體系吸收波長發(fā)生紅移，顏色變?yōu)樽仙?，初步?yàn)證了納米金比色法對(duì)ZEA檢測的可行性。

圖3 不同反應(yīng)體系的紫外吸收光譜圖及可視化結(jié)果

2.3 比色反應(yīng)條件優(yōu)化

在納米金鹽聚誘導(dǎo)比色反應(yīng)中，主要優(yōu)化了NaCl的濃度、ZEA適體的濃度以及比色反應(yīng)時(shí)間。NaCl濃度的大小與該反應(yīng)中納米金聚集變色有著直接的作用。如圖4a所示，當(dāng)NaCl的濃度在0～1 mol/L時(shí)，反應(yīng)體系的出峰位置和峰強(qiáng)度沒有改變。當(dāng)NaCl的濃度2 mol/L，特征峰右移，且反應(yīng)體系變?yōu)樽仙?，隨著濃度的增加，反應(yīng)體系的出峰位置在600～650 nm，體系顏色由紫色變?yōu)樗{(lán)色。可見，當(dāng) NaCl濃度較小時(shí)，不足以使未被保護(hù)的納米金聚集，當(dāng)NaCl濃度為2 mol/L時(shí)，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙f明部分納米金開始發(fā)生團(tuán)聚，隨著其濃度的增加，團(tuán)聚現(xiàn)象越為顯著，NaCl濃度為5 mol/L時(shí)，說明聚集反應(yīng)已完全，較高的濃度范圍已經(jīng)超出了適體對(duì)納米金的保護(hù)能力，所以NaCl的最優(yōu)濃度為 2 mol/L。

適體的濃度是此實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素，適體濃度要保證高于靶物濃度以達(dá)到完全與靶物反應(yīng)的目的，剩余的適體可保護(hù)納米金在高鹽溶液下部分聚集。因此適體濃度不能較低，否則不能完全特異性結(jié)合靶物，納米金則在體系中完全聚集；也不能完全過量，否則在與靶物結(jié)合的基礎(chǔ)上，剩余的適體足夠保護(hù)納米金，使反應(yīng)體系無顏色變化。如圖4b所示，當(dāng)反應(yīng)體系中未加靶物時(shí)，適體濃度較小則不足以保護(hù)納米金，使大部分納米金在高鹽溶液下聚集，當(dāng)適體濃度為3、5 μmol/L時(shí)，其出峰位置在520 nm處，峰強(qiáng)度相近，且體系顏色為紅色；適體濃度為1 μmol/L時(shí)，特征峰位置仍在520 nm處，峰強(qiáng)度相對(duì)降低；當(dāng)適體濃度小于 1 μmol/L時(shí)，特征峰右移，適體濃度為0.1 μmol/L時(shí)，520 nm處峰消失且在650 nm處出現(xiàn)新的特征峰。所以，適體濃度不應(yīng)小于1 μmol/L。當(dāng)反應(yīng)體系加入靶物后，反應(yīng)體系按照實(shí)驗(yàn)原理應(yīng)發(fā)生顏色的變化，即適體濃度不宜完全過量。根據(jù)圖4c結(jié)果可知，當(dāng)適體濃度為3、5 μmol/L時(shí)，其出峰位置在520 nm處，峰強(qiáng)度相近，且體系顏色為紅色，說明適體已完全過量；適體濃度為1 μmol/L時(shí)，其特征峰右移，體系顏色為紫色。所以適體最優(yōu)濃度為1 μmol/L。

如圖 4d所示，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為 5 min時(shí)，A650/A520的比值最大，當(dāng)時(shí)間小于5 min時(shí)，體系反應(yīng)還未完成，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)體系處于降解狀態(tài)，反應(yīng)體系顏色逐漸變淺。所以，最佳反應(yīng)時(shí)間為5 min。

2.4 納米金比色法測定ZEA

在前述優(yōu)化條件下，用納米金比色法測定不同濃度的 ZEA，得到了 ZEA標(biāo)準(zhǔn)液濃度與A650/A520比值的線性關(guān)系。如圖5a所示，在線性范圍 5～200 ng/mL內(nèi)，得到線性回歸方程y=0.249 3+0.000 4CZEA（R2=0.982 1），其最低檢測限為5 ng/mL。由圖5b可知，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下分別檢測ZEA和其他干擾物，僅有加入ZEA的體系溶液由紅色變?yōu)樽仙?，其A650/A520顯著高于其他干擾物，表明該檢測方法特異性良好。

圖5 不同濃度ZEA與A650/A520比值的線性關(guān)系（a）及特異性分析（b）

2.5 銀染時(shí)間優(yōu)化

如圖6所示，當(dāng)時(shí)間小于6 min時(shí)，ΔG（A630樣-A630空白）急劇增加，在此時(shí)Ag+在納米金表面被大量還原成Ag單質(zhì)；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為6 min時(shí)，ΔG的值最大，此時(shí)反應(yīng)速率達(dá)到最大；隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，AgNO3自身氧化成核，反應(yīng)體系處于降解狀態(tài)，顏色逐漸變淺。所以，最佳銀染時(shí)間為6 min。

圖6 銀染時(shí)間優(yōu)化

2.6 銀染增強(qiáng)性能

在最優(yōu)銀染條件下，獲得不同ZEA濃度與銀染后溶液吸光度值的線性關(guān)系。如圖7所示，當(dāng)ZEA濃度為0.1～20 ng /mL時(shí)，其濃度–吸光度線性回歸方程為y=0.054 3x+0.869 5（R2=0.981 9），回歸線性較好，最低檢測限為0.1 ng/mL。與銀染之前的最低檢出限5 ng/mL相比，靈敏度提高了50倍。

圖7 不同濃度ZEA與銀染吸光度值的線性關(guān)系

2.7 樣品檢測驗(yàn)證

分別利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法和酶聯(lián)免疫法對(duì)加標(biāo)濃度為10、50和100 ng/mL的玉米油和玉米樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果如表1所示，利用建立的方法測定實(shí)際樣品的回收率為81.23%～116.16%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為 4.72%～7.65%，與酶聯(lián)免疫法測定的結(jié)果基本一致，表明該方法對(duì)實(shí)際樣品檢測是可行的。

表1 實(shí)際樣品中ZEA的加標(biāo)回收率（n=3）

3 結(jié)論

探究基于核酸適體技術(shù)–納米金比色建立ZEA可視化的快速檢測方法。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，ZEA濃度在5～200 ng/mL范圍內(nèi)與體系的吸光度值呈良好的線性關(guān)系，最低檢測限為 5 ng/mL，且方法特異性良好。進(jìn)一步通過銀染作用將該方法的靈敏度提高了50倍。通過對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，其加標(biāo)回收率較好，成功的建立了一種簡便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果可視化的ZEA檢測新方法。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。