馬衛(wèi)賓?，張 迪，謝巖黎，趙文紅，孫淑敏

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南省糧油食品安全檢測(cè)與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

黃曲霉能夠侵染谷物、干果、飼料等食品，并產(chǎn)生致癌性代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素[1]，不僅造成食品質(zhì)量劣變和經(jīng)濟(jì)價(jià)值損失，還嚴(yán)重影響人類及動(dòng)物的健康[2]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計(jì)，全世界大約有四分之一的谷物受到真菌及其毒素污染，導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，例如美國(guó)每年因?yàn)檎婢舅匚廴驹斐傻膿p失約10億美元[3]。我國(guó)是糧食生產(chǎn)大國(guó)，在糧食采收、儲(chǔ)藏和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)發(fā)生的黃曲霉毒素污染造成了很大的損失和危害[4-5]。因此，急需尋找安全有效的方法控制糧油食品中黃曲霉及其毒素的污染。盡管人工合成抑菌劑已經(jīng)被廣泛用于控制食品中的微生物污染，但有研究表明不合理地使用人工合成殺菌劑可能會(huì)對(duì)人類健康及環(huán)境產(chǎn)生潛在不良影響，包括降解周期長(zhǎng)、毒性殘留和耐藥性[6-7]。目前，研發(fā)安全有效的天然抑菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工合成抑菌劑已成為食品領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)，其中植物源抑菌化合物由于具有安全性高等優(yōu)點(diǎn)，已越來(lái)越受到重視[8-9]。

植物源有機(jī)酸作為防腐劑在食品中的應(yīng)用已有上百年的歷史，例如苯甲酸、肉桂酸及其衍生物[10]。王勇[11]等報(bào)道了 14種小分子有機(jī)酸對(duì) 6種植物病原真菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)枯茗酸的抑菌活性最好，苯甲酸和肉桂酸次之。目前在食品領(lǐng)域常用的防腐劑多為有機(jī)酸及其鹽類，其中山梨酸及其鉀鹽由于抑菌性能好，并且安全性高，是FAO和WHO推薦的食品防腐劑[12]。草莓酸（反式-2-甲基-2-戊烯酸）天然存在于草莓的香味成分中，是美國(guó)食用香料與天然提取物制造者協(xié)會(huì)（FEMA）認(rèn)可的安全食用香料，也是我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB 2760—2014附錄中允許使用的食用香料。草莓酸具有新鮮草莓香氣，且?guī)в刑饾?rùn)的漿果樣香氣和酸味，是配制草莓香精的主香原料。作為一種天然有機(jī)酸類食用香料，關(guān)于草莓酸抑菌活性的研究未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中對(duì)天然有機(jī)酸的抑菌活性進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)草莓酸活性較好，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，本文以食品工業(yè)常用防腐劑山梨酸為陽(yáng)性對(duì)照，評(píng)價(jià)了草莓酸對(duì)人工培養(yǎng)基和儲(chǔ)藏花生中黃曲霉生長(zhǎng)和侵染的控制作用，為將其開(kāi)發(fā)成為天然、綠色、安全的食品防腐劑或糧食防霉劑提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓酸（純度≥98%）：西亞化學(xué)科技有限公司；山梨酸（純度≥99%）：上海麥克林生化科技有限公司（兩種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1所示）；黃曲霉菌：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心提供。

圖1 供試化合物結(jié)構(gòu)式

察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機(jī)械廠；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；GZX-DH-400BS型電熱恒溫干燥箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；MJ-250-I 霉菌培養(yǎng)箱：河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃曲霉孢子懸浮液制備

將于-20 ℃保存的黃曲霉菌取出，靜置至室溫，于恒溫培養(yǎng)箱（28±2）℃活化24 h后接種于察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d；無(wú)菌接種環(huán)刮取平板表面，并用 0.1%吐溫80的水溶液洗脫，三層無(wú)菌擦鏡紙過(guò)濾除去菌絲，制得孢子懸浮液；用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定稀釋至孢子懸浮液濃度為106～107個(gè)/mL[13]。

1.2.2 草莓酸對(duì)黃曲霉的離體抑菌活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[14-15]中的方法并稍加改進(jìn)，具體為：根據(jù)設(shè)定的抑菌實(shí)驗(yàn)所用梯度濃度，分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的草莓酸并將其溶于1 mL無(wú)水乙醇中，然后緩慢加入到4 mL 20%的吐溫80水溶液中，充分渦旋至完全混勻，制得草莓酸測(cè)試母液；同樣方法設(shè)置山梨酸陽(yáng)性對(duì)照組（準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)表明所用溶劑體系對(duì)供試菌種生長(zhǎng)無(wú)影響，故正式實(shí)驗(yàn)不再設(shè)溶劑對(duì)照組）。用移液槍吸取1 mL測(cè)試母液滴加到無(wú)菌培養(yǎng)皿中與19 mL滅菌察氏培養(yǎng)基混勻，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（20 mL滅菌察氏培養(yǎng)基），冷凝后備用。用移液槍吸取5 μL新鮮孢子懸浮液，接種至制備的培養(yǎng)基表面中間，（28±2）℃條件下培養(yǎng)8 d。每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，十字交叉法測(cè)量菌落直徑。按照以下公式計(jì)算抑菌率：

抑菌率(% ) = （dc-dt） /dc×100%

式中：dc為對(duì)照組中菌絲平均直徑（cm）；dt為實(shí)驗(yàn)組中菌絲平均直徑（cm）。

1.2.3 草莓酸對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉的抑菌活性

參照文獻(xiàn)中的方法[7,16]并稍加改進(jìn)，具體為：挑選顆粒飽滿無(wú)霉菌污染的花生粒，用1%次氯酸鈉溶液浸泡2 min消毒種子表面，無(wú)菌水沖洗干凈后浸泡4 h調(diào)節(jié)水分含量，無(wú)菌環(huán)境下晾干花生粒表面水分備用。取1mL測(cè)試化合物母液（配制方法同1.2.2）加入到19 mL孢子懸浮液中充分混勻，立刻將經(jīng)過(guò)消毒和水分調(diào)質(zhì)的花生粒浸入到含藥孢子懸浮液中并稍加攪拌，1 min后取出花生粒在無(wú)菌環(huán)境下置于滅菌濾紙上，每個(gè)濃度取14～16粒花生平放于培養(yǎng)皿中，用 Parafilm迅速密封，（28±2）℃條件下培養(yǎng)5 d。設(shè)置空白對(duì)照，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以花生粒表面是否長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)菌絲為標(biāo)準(zhǔn)，每隔24 h觀察并統(tǒng)計(jì)受黃曲霉污染的霉變花生粒數(shù)量。按照以下公式計(jì)算霉變率：

花生霉變率(%)= C /T× 100%

式中：C為霉變花生粒數(shù)量（粒），T為花生?？倲?shù)量（粒）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和Origin 8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 草莓酸與山梨酸對(duì)黃曲霉菌的離體抑菌活性

最小抑菌濃度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）是測(cè)定化合物抑菌活性的重要參數(shù)[17]。對(duì)比研究不同作用濃度及作用時(shí)間條件下，草莓酸與山梨酸對(duì)黃曲霉的離體抑菌活性，進(jìn)而確定二者的MIC。圖2-A表明，供試濃度梯度下，草莓酸與山梨酸均對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)顯示出抑制效果，并且二者對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)的抑制作用呈濃度依賴性。通過(guò)對(duì)比圖2-A數(shù)據(jù)可知，隨著供試濃度的增大，草莓酸濃度達(dá)到0.6 g/L時(shí)，對(duì)黃曲霉生長(zhǎng)抑制率為100%，而山梨酸在濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)，能夠完全抑制黃曲霉的生長(zhǎng)。由此可知二者對(duì)黃曲霉的MIC分別為0.6和1.0 g/L。根據(jù)圖2-B的數(shù)據(jù)以及圖2-C的實(shí)物照片，可以看出隨著兩種化合物作用濃度的增加，黃曲霉的生長(zhǎng)受到抑制的程度逐漸加深；同時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，黃曲霉菌絲生長(zhǎng)的菌落直徑不斷變大，但與空白對(duì)照組相比，處理組黃曲霉菌落直徑變化受到不同程度抑制，菌絲生長(zhǎng)速率明顯變慢，生長(zhǎng)狀況出現(xiàn)延遲。如草莓酸0.4 g/L、山梨酸0.8 g/L濃度下，培養(yǎng)8 d時(shí)的黃曲霉菌落大小與空白對(duì)照培養(yǎng)2 d的菌落大小相當(dāng)，菌絲生長(zhǎng)延遲了大約6 d。從以上結(jié)果可以看出，離體條件下草莓酸對(duì)黃曲霉的抑菌活性要優(yōu)于食品工業(yè)常用防腐劑山梨酸。

2.2 草莓酸與山梨酸對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉的抑菌活性

基于草莓酸對(duì)黃曲霉的離體抑菌活性研究結(jié)果，進(jìn)一步研究了草莓酸對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉生長(zhǎng)的實(shí)際控制效果，并與山梨酸進(jìn)行了對(duì)比。由圖3-A可知花生霉變率隨著草莓酸和山梨酸濃度的增加而逐漸降低。當(dāng)其草莓酸濃度為 10.0 g/L時(shí)，能夠完全抑制儲(chǔ)藏花生中黃曲霉的侵染；草莓酸在5.0 g/L時(shí)能夠使花生的霉變率降低50%以上。陽(yáng)性對(duì)照山梨酸在濃度達(dá)到20.0 g/L時(shí)，能夠完全抑制黃曲霉在花生上的生長(zhǎng)；在 5.0～15.0 g/L濃度范圍內(nèi)，山梨酸能使花生霉變率有不同程度的降低。圖3-C展示了培養(yǎng)5 d后不同濃度草莓酸和山梨酸處理對(duì)儲(chǔ)藏花生霉變率影響的實(shí)物照片，可以看出空白對(duì)照組中的花生已經(jīng)全部被黃曲霉污染，菌絲布滿花生表面；而草莓酸和山梨酸能夠有效控制黃曲霉對(duì)花生的侵染，使花生中的黃曲霉生長(zhǎng)變緩，降低花生的霉變率。

根據(jù)圖3-B的數(shù)據(jù)曲線變化趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)兩種化合物作用濃度低于完全抑制濃度時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，花生的霉變率逐漸增加；但與空白對(duì)照組相比，處理組花生霉變率的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯變慢，花生發(fā)生霉變的時(shí)間出現(xiàn)不同程度的延遲。通過(guò)對(duì)比圖3中的數(shù)據(jù)可知，草莓酸對(duì)花生中黃曲霉侵染的抑制效果要優(yōu)陽(yáng)性對(duì)照山梨酸。本研究結(jié)果表明草莓酸對(duì)黃曲霉具有良好的抑制活性，為研發(fā)新型有機(jī)酸類食品防腐劑提供了基礎(chǔ)和參考，值得進(jìn)一步深入研究。

圖2 山梨酸與草莓酸不同作用濃度（A）、不同作用時(shí)間（B）對(duì)黃曲霉的離體抑菌活性及實(shí)物照片（C）

圖3 山梨酸與草莓酸在不同作用濃度（A）及作用時(shí)間（B）條件下對(duì)花生儲(chǔ)藏過(guò)程中黃曲霉的控制作用及實(shí)物照片（C）

草莓酸和山梨酸均為短鏈脂肪酸，二者有著相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但本研究發(fā)現(xiàn)草莓酸對(duì)黃曲霉的抑制活性優(yōu)于山梨酸，這種活性上的差異可以在構(gòu)效關(guān)系方面作進(jìn)一步探討。有研究人員通過(guò)對(duì)比研究 30余種飽和或不飽和脂肪酸對(duì)大腸桿菌和白色念珠菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵數(shù)目、雙鍵位置以及取代基團(tuán)的不同對(duì)其抑菌活性有非常大的影響[18]。寧正祥[19]等對(duì)含α,β-不飽和羰基化合物分子結(jié)構(gòu)特性及其抗菌活性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)這類防腐劑的抗菌活性與分子疏水性和分子最低空軌道能量有關(guān)。于輝[20]通過(guò)量子化學(xué)研究，表明 1,3-丁二烯的交替碳碳雙鍵骨架對(duì)山梨酸的羧基提供有力的支持，羧基和C1的電子云密度較大，是山梨酸的抗菌活性中心。草莓酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)比山梨酸少一個(gè)碳碳雙鍵，但在α碳位置多一個(gè)甲基，這種結(jié)構(gòu)上的變化對(duì)抑菌活性的影響機(jī)理值得進(jìn)一步研究，可為抑菌活性化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供借鑒和啟發(fā)。

3 結(jié)論

本研究以黃曲霉菌為供試菌種，并以山梨酸為陽(yáng)性對(duì)照，采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定了天然食品香料草莓酸對(duì)黃曲霉菌的離體抑菌活性，并在實(shí)驗(yàn)室條件下評(píng)估了該化合物對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉菌的控制作用發(fā)現(xiàn)草莓酸的抑菌活性優(yōu)于山梨酸。離體條件下草莓酸對(duì)黃曲霉的最小抑菌濃度為0.6 g/L，山梨酸為1.0 g/L?；ㄉ鷥?chǔ)藏防霉試驗(yàn)表明，草莓酸對(duì)儲(chǔ)藏花生中黃曲霉侵染和生長(zhǎng)的有效控制濃度為10.0 g/L，山梨酸在20.0 g/L時(shí)才能完全抑制黃曲霉在儲(chǔ)藏花生中的生長(zhǎng)。

盡管山梨酸、苯甲酸等防腐劑已在食品工業(yè)得到了廣泛的應(yīng)用，但仍有一些問(wèn)題需要進(jìn)一步解決。比如安全性問(wèn)題，有些防腐劑對(duì)人體具有潛在毒性，如苯甲酸及其鹽類具有一定的致突變作用和遺傳毒性[21]。山梨酸比苯甲酸安全性更高，但山梨酸對(duì)霉菌、酵母生長(zhǎng)具有較好抑制作用，對(duì)細(xì)菌作用卻不強(qiáng)[22]。隨著消費(fèi)者對(duì)食品安全的要求越來(lái)越高，尋找和開(kāi)發(fā)廣譜、安全、高效的新型食品防腐劑已成為食品行業(yè)關(guān)注的研究熱點(diǎn)[23]。本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)圍繞天然食品防腐劑和糧食防霉劑進(jìn)行了持續(xù)研究，并取得一些進(jìn)展[24-25]。本研究選用的草莓酸存在于草莓的香味物質(zhì)組分中，并且是一種天然食用香料，在安全性方面具有優(yōu)勢(shì)。后期可進(jìn)一步研究草莓酸鈉鹽、鉀鹽的抑菌活性，并且擴(kuò)大抑菌譜的篩選，為其實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù)。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。