王冠霖， 肖 坤， 許 旭

(上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 上海 201418)

我國(guó)是一個(gè)油料進(jìn)口大國(guó)，各類(lèi)食用油及原料進(jìn)口數(shù)量較大[1]，增加食用油供應(yīng)并改善其品質(zhì)是需要解決的重要議題之一[2]。黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于各類(lèi)植物中，具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗炎、提高免疫力、抗病毒、抗氧化等藥理學(xué)活性[3-5]。不同植物中的黃酮成分存在差異[6-7]，對(duì)食用植物油的營(yíng)養(yǎng)和使用有一定影響，可為區(qū)分不同食用油及其摻假提供依據(jù)；測(cè)定食用植物油中的總黃酮含量也可為進(jìn)一步研究其中的黃酮成分種類(lèi)和含量奠定基礎(chǔ)。

分光光度法常用于總黃酮的測(cè)定[8]，在中性或弱堿性及亞硝酸鈉存在條件下，黃酮類(lèi)化合物與鋁鹽生成絡(luò)合物，在堿性條件下顯色,可用于定量分析總黃酮含量。張志華等[9]直接用該法測(cè)定了玉米油中的總黃酮。但在食用油分析時(shí)，在處理油脂樣品時(shí)存在一定困難。余旭亞等[10]用無(wú)水乙醇稀釋后測(cè)定了核桃油中的總黃酮。張志英等[11]利用60%甲醇溶液對(duì)山茶油樣品進(jìn)行萃取，經(jīng)氮吹、復(fù)溶后，測(cè)定山茶油中黃酮含量為(8.98±0.54) mg/kg(以蘆丁計(jì))。Zheng等[12]通過(guò)固相萃取處理樣品，氮吹、復(fù)溶后，測(cè)定不同制取工藝制作的各沙棘油樣品，其中總黃酮含量約為4.11～14.18 mg/100g(以槲皮素計(jì))。實(shí)驗(yàn)中，油脂樣品在不同的前處理時(shí)仍然存在乳化或者大量稀釋的問(wèn)題，影響后續(xù)的分光光度法測(cè)定。因此，食用油中黃酮分析的樣品預(yù)處理方法仍然是需要研究的問(wèn)題。

本文提出用氫氧化鉀乙醇溶液皂化食用油的樣品處理方法，使食用油樣品和反應(yīng)試劑的各種溶液可以充分混合互溶，有利于實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確靈敏的總黃酮檢測(cè)分析，并實(shí)際用于食用油樣品中總黃酮的分析。

1 材料與儀器

TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；Nicolet iN10型紅外光譜儀(美國(guó)Thermo-Fisher公司)；正己烷、乙酸乙酯、三油酸甘油酯、無(wú)水乙醇、蘆丁、氫氧化鉀、亞硝酸鈉、九水硝酸鋁、硅膠(100～200 目)等均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。叔丁基?duì)苯二酚(TBHQ，含量98%+)、豆甾醇(含量95%)、茶多酚(50%)均為Adamas產(chǎn)品。活性白土購(gòu)自上海九潔實(shí)業(yè)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為屈臣氏蒸餾水。食用油樣品(福臨門(mén)一級(jí)大豆油，魯花壓榨玉米油)均購(gòu)自本地超市。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液及其他溶液的配制

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取蘆丁 0.027 7 g超聲溶于乙酸乙酯，并定容至100 mL。

氫氧化鉀-乙醇溶液：稱取6.4 g氫氧化鉀溶于100 mL的95%乙醇中。

4%亞硝酸鈉溶液、4%九水硝酸鋁溶液：各稱取2.0 g試劑分別溶于50 mL的80%乙醇水溶液中。

2.2 作為溶劑的脫色油樣處理

取大豆油50 mL加入50 mL正己烷混勻，取除去填料的固相萃取空柱管(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)一支，加入清洗烘干后的硅膠(粒徑75～150 μm，100～200目)制作柱長(zhǎng)約為5～7 cm的硅膠柱，將混勻的油樣常壓通過(guò)硅膠柱，再用一支同樣自制的6～8 g活性白土柱對(duì)流出液在10 mL/min流速下進(jìn)行二次吸附。得到的溶液蒸干除去正己烷待用。其中的總黃酮含量用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定。

2.3 皂化反應(yīng)

取6個(gè)10 mL離心管，向其中各加入2.2中脫色油樣500 μL，依次加入0(不加)、200、400、600、800、1 000 μL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混合30 s。放入80 ℃水浴中，分別加入氫氧化鉀-乙醇溶液 1 000 μL，保持熱80 ℃水浴15 min。

2.4 顯色反應(yīng)

向2.3所述離心管中加入500 μL質(zhì)量濃度為4%的亞硝酸鈉水溶液，震蕩，水浴6 min后，加入500 μL質(zhì)量濃度為4%的九水合硝酸鋁水溶液，震蕩混勻，水浴6 min，此時(shí)溶液會(huì)有大量白色沉淀，向其中加入2 mL氫氧化鉀-乙醇溶液，搖勻后，取出離心管冷至室溫，此時(shí)溶液為黃棕色透明澄清液體。加入氫氧化鉀-乙醇溶液定容后至10 mL，溶液中殘留少許白色沉淀不影響測(cè)定。離心后取上清液用紫外分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)353 nm處，以無(wú)水乙醇為空白，測(cè)各溶液的吸光度，用含蘆丁溶液(加上標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定的脫色油樣中總黃酮含量作為濃度值)測(cè)定的吸光度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2.5 樣品吸光度測(cè)量與含量測(cè)定

選取λ=353 nm作為測(cè)量波長(zhǎng)。直接吸取 1 000 μL油樣至10 mL容量瓶，按上述2.3從“放入80 ℃水浴中”開(kāi)始，以及2.4的步驟，至測(cè)定吸光度。同一樣品重復(fù)取樣3次平行測(cè)定，根據(jù)2.4中得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，算出食用油樣品中總黃酮的含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品前處理方法選擇

實(shí)驗(yàn)中樣品為食用油，疏水性強(qiáng)且黏度高，嘗試按照文獻(xiàn)方法[9-10]直接或者稀釋后加入亞硝酸鈉進(jìn)行顯色反應(yīng)時(shí)，溶液有部分呈乳濁狀態(tài)，難以進(jìn)行分光光度測(cè)定?？紤]到文獻(xiàn)中的方法比較復(fù)雜[11]、或需要大量稀釋[12]，且黃酮化合物在堿性條件下較為穩(wěn)定，故嘗試將食用油樣品皂化。比較不同的皂化條件，在使用氫氧化鉀的95%乙醇溶液，水浴80 ℃條件下15 min，油樣皂化后可以充分溶解在乙醇中，溶液保持透明且與后續(xù)顯色溶液互溶，沒(méi)有出現(xiàn)乳化問(wèn)題，可用于后續(xù)的顯色實(shí)驗(yàn)和分光光度測(cè)定。故選擇氫氧化鉀-乙醇溶液為前處理皂化反應(yīng)堿液。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

實(shí)驗(yàn)中使用水、甲醇、三油酸甘油酯作為溶劑配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行比較。結(jié)果，三油酸甘油酯由于顏色深影響吸光度測(cè)定，水溶液由于和食用油反應(yīng)體系差異較大造成吸光度測(cè)定存在明顯偏差，使用甲醇溶液則幾乎不發(fā)生顯色反應(yīng)?？紤]到與食用油樣品一致，最后采用脫色后的食用油加入蘆丁乙酸乙酯溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)驗(yàn)中嘗試過(guò)硅膠、活性白土、凹凸棒土、沸石、活性炭等作為吸附脫色劑對(duì)食用油進(jìn)行脫色處理，結(jié)果單一使用以上1種脫色劑效果不佳，而采用硅膠脫色加活性白土二次脫色后的食用油能基本脫除顏色，且吸光度測(cè)量結(jié)果顯示，測(cè)量值與加入值相近，該法脫色后的食用油黃酮含量較低，易于配制所需濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.3 實(shí)驗(yàn)條件選擇

波長(zhǎng)選擇。以無(wú)水乙醇為參比，在TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上直接掃描300～800 nm范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)溶液的吸收光譜，吸收峰值均在λ=353 nm左右且該波長(zhǎng)附近吸光度變化較小，故實(shí)驗(yàn)選取λ=353 nm作為測(cè)量波長(zhǎng)。

皂化及顯色實(shí)驗(yàn)溫度。為方便實(shí)驗(yàn)，兩者使用了相同的水浴溫度。比較了室溫、50 ℃水浴、80 ℃水浴、沸水浴，結(jié)果表明室溫及50 ℃水浴條件下皂化反應(yīng)及絡(luò)合顯色反應(yīng)進(jìn)行較慢，而沸水浴加熱條件下會(huì)使乙醇大量蒸發(fā)導(dǎo)致溶液出現(xiàn)分層現(xiàn)象，故選擇80 ℃水浴。

顯色反應(yīng)溶劑。嘗試使用亞硝酸鈉及硝酸鋁的水溶液，但在加入含有乙酸乙酯的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和脫色油樣后，仍然會(huì)發(fā)生可見(jiàn)的溶液分層。選擇含水乙醇溶解顯色試劑可以避免分層現(xiàn)象。

水浴過(guò)程中加入硝酸鋁溶液后出現(xiàn)了白色沉淀物質(zhì)，在加入乙醇定容后也會(huì)出現(xiàn)少量白色沉淀，取這些白色沉淀用紅外光譜儀分析，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)譜圖檢索對(duì)比，兩種沉淀均主要為氫氧化鋁。嘗試將沉淀復(fù)溶于乙醇-水中，在實(shí)驗(yàn)選定的353 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度為零，可以認(rèn)為沉淀中不含黃酮類(lèi)化合物及其顯色成分?？紤]到最終的沉淀物較少，故用無(wú)水乙醇定容混勻后離心，取上層清液測(cè)定。

通?？墒褂貌患犹J丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的脫色油樣顯色溶液作為參比溶液測(cè)定吸光度。實(shí)驗(yàn)中，以無(wú)水乙醇為參比溶液，測(cè)定的該不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的脫色油樣吸光度值一直很穩(wěn)定，說(shuō)明可以用無(wú)水乙醇為參比溶液。為方便實(shí)驗(yàn)，本法建議使用無(wú)水乙醇為參比，并測(cè)定不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的脫色油樣顯色后的吸光度，以便評(píng)價(jià)脫色油樣的可靠性。

3.4 方法認(rèn)證

3.4.1 精密度

取大豆油樣品，按照2.3的峰方法重復(fù)處理并測(cè)定吸光度，考察其日內(nèi)精密度、日間精密度。結(jié)果表明，測(cè)得的日內(nèi)精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為0.82%，日間精密度RSD為1.8%。

3.4.2 脫色油樣中總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定

在波長(zhǎng)λ=353 nm處，以無(wú)水乙醇為參比溶液，通過(guò)在脫色溶液中加入不同量的黃酮(蘆丁)標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其添加蘆丁濃度對(duì)吸光度的擬合曲線方程為y=0.147 6x+0.205(相關(guān)系數(shù)R2=0.996 5)，按標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算得到該脫色溶液中的總黃酮含量為1.39 mg/L，該濃度遠(yuǎn)低于大豆油樣品中黃酮的含量，可用于配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.4.3 線性與標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)3.4.1的結(jié)果，將各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度中蘆丁濃度加上脫色油樣的濃度1.39 mg/L，作為黃酮標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與吸光度擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=0.147 6x+0.000 03，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 5。

3.4.4 干擾成分考察

考察了食用油中存在的其他成分對(duì)本法的影響。結(jié)果表明，加入10%的甘油三酯類(lèi)成分(除其本身顏色外)對(duì)顯色反應(yīng)沒(méi)有影響，而且實(shí)驗(yàn)中使用的脫色油樣中主要成分即為甘油三酯。按照2.2的方法將蘆丁依次更換為1～2 mg/mL 的TBHQ(叔丁基對(duì)苯二酚，常用的食用油添加劑)、豆甾醇、茶多酚進(jìn)行顯色反應(yīng)，吸光度均與不加的空白樣品相同。如食用油中存在1～2 mg/mL的抗氧化劑、甾醇、多酚類(lèi)成分，這幾種成分對(duì)本法沒(méi)有干擾。

3.4.5 回收率

取大豆油樣品，按照2.3的方法測(cè)定并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量，在同批次樣品中加入精確稱取的蘆丁標(biāo)樣，同步進(jìn)行顯色反應(yīng)，并對(duì)其總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算方法的回收率見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，脫色油樣中的濃度遠(yuǎn)低于實(shí)際植物油樣品中的濃度，說(shuō)明本法使用經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定黃酮含量的脫色油樣制備標(biāo)準(zhǔn)溶液是可行的，且不會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。

表1 加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

3.5 實(shí)際樣品測(cè)定

取大豆油和玉米油樣品，按2.3的方法平行測(cè)定3次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的含量，結(jié)果玉米油樣品中總黃酮含量為(10.11±0.04) mg/L，大豆油樣品中總黃酮含量為(13.06±0.09) mg/L。

4 結(jié) 語(yǔ)

建立了食用油樣品皂化后顯色-分光光度法測(cè)定總黃酮含量的方法。以蘆丁為黃酮類(lèi)成分的標(biāo)樣，樣品和標(biāo)樣經(jīng)皂化、鋁鹽絡(luò)合顯色，在353 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。已知的食用油主要成分對(duì)本法沒(méi)有干擾。本方法通過(guò)對(duì)樣品的皂化處理，避免了使用文獻(xiàn)方法時(shí)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的乳化現(xiàn)象、及其對(duì)吸光度測(cè)定的干擾，具有較好的精密度和準(zhǔn)確度，且操作簡(jiǎn)便，已用于大豆油和玉米油實(shí)際樣品的測(cè)定。